《Genes》：Genome-Wide Identification and Expression Analysis of NHX Gene Family in Ziziphus jujuba var. spinosa Under Salt and Drought Stress
Lulu Li,
Xiaojun Ma,
Xinhong Wang,
Congcong Liu,
Xiaohan Tang,
Dali Geng,
Xuexiang Li,
Aiqin Ding and
Jing Shu
编辑推荐：
本研究通过基因组学与分子生物学手段，在药用植物酸枣(Ziziphus jujuba var. spinosa)中全基因组鉴定了8个ZjNHX基因，并系统解析了其进化关系、结构与表达模式。研究发现，这些基因响应盐胁迫上调表达，尤其ZjNHX1在根部3小时内表达量激增约40倍，揭示了NHX基因家族在酸枣耐盐适应中的核心作用，为利用其遗传资源培育抗逆枣树品种提供了关键靶点与理论基础。
1. 引言
土壤盐渍化是全球农业与生态环境可持续发展面临的主要非生物胁迫因子之一。据统计，全球有超过10亿公顷土地受到盐分影响，其中中国盐渍化土壤面积达2.1174亿公顷，位居世界前列。盐分导致渗透压升高、水分可利用性降低，特别是高浓度的Na+会破坏植物体内离子稳态，引发渗透胁迫、离子毒性和氧化损伤，最终抑制植物生长发育，导致产量与品质下降。
在长期进化过程中，部分植物逐渐适应了盐碱环境。酸枣(Ziziphus jujuba var. spinosa)便是其中之一。在中国，酸枣是重要的经济果树，对盐碱、贫瘠和干旱条件表现出显著的耐受性，即使在5‰盐度的土壤中也能维持正常生理代谢。其果肉富含维生素、多糖和微量元素；嫩芽和叶片可加工成代用茶和保健品；耐逆性强的幼苗广泛用作栽培枣的砧木；种子（酸枣仁）是著名的传统中药材，因其镇静安神功效在临床上广泛应用。酸枣这种固有的耐盐碱特性，促使我们进一步探究其背后的适应机制。
为应对盐胁迫，植物在生理和分子层面演化出一系列复杂机制。其中，Na+/H+逆向转运蛋白(NHXs)是维持盐胁迫下渗透平衡和离子稳态的核心，调控胞质中的钠(Na+)、钾(K+)和氢离子(H+)浓度。NHX属于CPA1超家族，是一种由约550个氨基酸残基组成的膜蛋白，具有典型的转运蛋白结构。编码的蛋白含有一个高度保守的Na+/H+交换结构域，通常维持10-12个跨膜结构域。此外，大多数NHX蛋白在第四跨膜段包含一个高度保守的14个残基基序，其共有序列为FF(I/L)(Y/F)LFLLPPI，该区域被认为是阿米洛利及其衍生物的结合位点。根据序列同源性和亚细胞定位，植物NHX家族可分为三个不同的功能类别：质膜(PM)类、液泡(Vac)类和内体相关(Endo)类，其中液泡和内体相关类属于细胞内类。不同亚类的NHX蛋白表现出显著的功能分化。
在拟南芥中，已鉴定出8个NHX基因。其中六个作为细胞内转运蛋白，根据其亚细胞定位进一步分为液泡组和内体相关组。液泡膜类型包括AtNHX1至AtNHX4。研究表明，这类基因利用V型H+-ATP酶和H+-焦磷酸酶产生的质子梯度，将胞质中过量的Na+区隔化到液泡中，从而降低Na+毒性，维持胞质中适当的K+/Na+比率，并通过溶质积累支持渗透调节。最近的研究还揭示，NHX蛋白除了将Na+隔离到液泡中，还可能通过在盐分条件下调节细胞内K+稳态来增强植物的耐盐性。此外，液泡定位的同工型AtNHX1至AtNHX4在运输Na+与K+的选择性方面存在明显的功能差异。AtNHX5/6属于内体型。研究表明，内体定位的NHX转运蛋白在维持细胞内离子稳态和pH、调节蛋白质加工和细胞货物运输方面起着关键作用，同时也是植物正常生长所必需的。AtNHX7/SOS1和AtNHX8属于质膜定位蛋白，它们与CBL-CIPK信号通路协同作用，将Na+排出细胞外。然而，这种将Na+排出细胞的过程会进一步加剧膜两侧渗透压和离子浓度的不平衡，因此该机制仅具有短暂的耐盐性，无法使植物在自然环境条件下具备长期的耐盐能力。此外，一些研究者将质膜定位蛋白归类为SOS1基因家族。研究发现，NHX和SOS1基因家族具有非常不同的进化轨迹，并认为这些不同的进化历史与其功能和细胞定位的进化有关。
大量研究证实，Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性中起着至关重要的作用，并在基因工程应用中具有潜力。这种潜力体现在，无论是异源还是同源过表达NHX基因，都能显著增强植物的耐盐性。例如，研究发现将葡萄的液泡NHX逆向转运蛋白基因VvNHX1导入马铃薯后，转基因植物在盐胁迫下表现出更高的生长速率、耐受性和更低的钠离子积累。此外，过表达萝卜的RsNHX1基因增强了拟南芥的耐盐性。相反，内源性RsNHX1被沉默的植物对盐胁迫更为敏感，这表明RsNHX1是萝卜盐胁迫抗性的正调控因子。此外，过表达来自马蔺的IlNHX的转基因烟草植物可以通过增加V-ATP酶活性将更多的Na+区隔化到液泡中。该机制在盐胁迫下维持了Na+/K+稳态，提高了光合能力，并保持了质膜完整性。在应用研究中，NHX基因已成为棉花和水稻等作物培育抗逆品种的关键靶点。例如，表达菊芋的HtNHX1或HtNHX2提高了水稻的耐盐性。特别是，HtNHX2的表达在钾限制性盐胁迫或一般营养缺乏条件下增加了水稻的籽粒产量、收获指数和总养分吸收。具体而言，通过转基因方法过表达NHX基因可显著提高耐盐性，使番茄植株在高盐条件下维持生长、开花和果实产量。同时，由这些基因介导的液泡Na+区隔化最大程度地减少了果实中的钠积累，从而保护果实品质免受盐分相关损害。总的来说，这些研究肯定了NHX基因是作物耐盐性遗传改良的重要候选基因，具有显著的应用潜力。
近年来，随着基因组测序技术的飞速发展，NHX基因家族已在多种植物（包括作物、园艺植物和耐盐模式植物）中在全基因组水平上得到鉴定和功能表征。这些研究阐明了NHX基因家族独特的结构特征、保守基序和进化模式。此外，越来越多的证据表明，NHX蛋白不仅有助于耐盐胁迫，而且在植物生长发育中发挥着关键作用。液泡膜定位的NHX蛋白对于K+主动吸收进入液泡、调节细胞膨胀压和正常气孔功能至关重要。研究表明，拟南芥AtNHX5和AtNHX6参与胚胎发生和根组织发育过程中生长素浓度的建立和维持。此外，这些蛋白还在油菜素内酯信号通路中发挥作用。总之，NHX基因贯穿整个植物生长周期，其表达受到多种胁迫条件和植物激素的显著诱导。
尽管酸枣表现出相当的耐盐性，但其潜在的分子机制在很大程度上仍未得到探索。鉴于NHX转运蛋白在植物耐盐性中的核心作用，对该物种NHX基因家族进行系统鉴定和表征，对于理解其适应策略以及利用其在枣树育种中的遗传潜力至关重要。作为一种具有抗逆性的野生近缘种，酸枣很可能拥有独特且具有不同进化和功能特征的NHX变异体。本研究利用酸枣的全基因组数据，通过整合生物信息学方法，全面鉴定了其NHX基因家族的所有成员。对其系统发育关系、基因结构、保守基序、染色体分布、共线性模式、顺式调控元件以及在不同组织和非生物胁迫下的表达谱进行了系统分析。本研究旨在阐明酸枣NHX基因家族的进化特征和潜在功能，从而为研究其在胁迫响应中的调控作用奠定坚实基础，并指导后续的功能验证。最终，这些发现将为培育耐盐枣树品种提供关键的遗传资源。
2. 材料与方法
2.1. 酸枣NHX基因的全基因组鉴定
从figshare存储库检索了酸枣的全基因组注释数据。从拟南芥信息资源中心下载了8个拟南芥NHX蛋白序列。为了鉴定酸枣中的候选基因，使用AtNHX1-AtNHX8序列作为查询，在TBtools软件中使用严格的E值截断1×10?5进行BLASTP搜索。同时，从Pfam数据库获取了与保守NHX结构域相对应的隐马尔可夫模型谱。该HMM谱用于在初步筛选后以严格的E值阈值1×10?5验证候选蛋白。只有那些被BLASTP和HMM搜索共同识别的序列最终被指定为ZjNHX基因家族的成员。候选序列被提交到NCBI CDD和SMART数据库，以确保所有鉴定出的成员都包含具有默认参数设置的特征性Na+/H+交换结构域。
2.2. 染色体定位与蛋白质理化性质分析
基于酸枣的基因组注释数据，使用TBtools软件可视化了已鉴定ZjNHX基因的染色体定位。对于蛋白质表征，使用ExPASy服务器上的ProtParam工具计算了理论等电点、分子量和不稳定指数等理化参数。然后使用TMHMM-2.0程序识别了ZjNHX蛋白中的跨膜螺旋区域。进一步分析包括使用SOPMA预测二级结构组成，并通过SWISS-MODEL平台上的同源建模构建三级结构。最后，使用Plant-mPLoc服务器预测了每个ZjNHX蛋白的亚细胞定位。
2.3. 系统发育树构建与分析
使用MEGA软件中的MUSCLE在默认参数下进行多序列比对。随后，基于来自酸枣、拟南芥、西葫芦、茶树、水稻、胡杨、石榴、番茄、普通小麦和葡萄的NHX蛋白序列进行了系统发育分析。最大似然分析采用JTT模型，并结合了Gamma分布和不变位点来模拟位点间的速率异质性。ML树的启发式搜索采用最近邻交换法，初始树自动生成。节点支持度使用自举法（1000次重复）进行评估。最后，使用iTOL在线工具对系统发育树进行可视化和注释。
2.4. 保守基序与基因结构分析
使用MEME套件预测了所有ZjNHX蛋白的保守基序，基序数量从默认的3个扩展到10个。使用InterPro数据库进行基序功能注释。为了分析基因结构，通过使用TBtools将每个ZjNHX基因的编码序列与其相应的基因组DNA序列进行比对，确定了其外显子-内含子结构。最后，使用DNAMAN软件在默认参数下对保守结构域进行了多序列比对。
2.5. 共线性与选择压力分析
对于酸枣ZjNHX基因家族成员的种内和种间同线性分析，使用了TBtools中的MCScanX插件。所有同线性基因对的编码序列使用MAFFT进行比对。为了评估同义替换是否饱和，使用DAMBE进行了替换饱和检验。使用TBtools计算了同线性基因对的Ka、Ks和Ka/Ks值。分化时间通过公式T = Ks/(2r) × 10?6百万年进行估计，其中Ks表示每个同义位点的同义替换数，r表示双子叶植物特异性替换速率。
2.6. 顺式作用元件分析
为了研究潜在的转录调控，使用TBtools从每个ZjNHX基因的转录起始位点上游提取了2 kb序列，这些序列被指定为推定的启动子区域。然后通过查询PlantCARE数据库鉴定了这些序列中推定的顺式作用调控元件。将鉴定出的元件分为胁迫响应、激素相关、植物发育和光响应组，并使用Graphpad Prism软件进行可视化。
2.7. 基于RNA-Seq数据的表达分析
本研究使用的RNA-seq数据来自NCBI序列读取档案中的两个公开数据集。盐胁迫数据集包含用0、100和200 mM NaCl处理3天和8天的酸枣根和叶样本。干旱胁迫数据集包括来自二倍体和四倍体植物经受0、6、12和48小时干旱处理的叶样本。原始读取首先通过SRA工具包转换为FASTQ格式。使用Trimmomatic进行接头修剪和质量过滤后，使用FastQC评估读取质量。然后使用STAR将得到的高质量读数比对到酸枣参考基因组，并同时处理基因组索引和读取比对。使用TBtools中的Kallisto Super Wrapper插件提取ZjNHX基因的表达矩阵，随后使用同一软件生成表达模式热图。
2.8. 植物材料与处理
酸枣种子采集自中国河北省赞皇县。选取饱满均匀的健康种子，用6-14%次氯酸钠溶液表面消毒15分钟，然后用无菌蒸馏水连续冲洗六次。消毒后的种子在30°C恒温培养箱中浸泡两天以促进发芽。随后，将种子播种在装有蛭石和营养土混合物的育苗盘中。幼苗在22-25°C、光周期16小时光照/8小时黑暗的条件下培养。播种后60天，将生长一致的幼苗移栽到新的穴盘中。经过一周的适应期后，所有幼苗用150 mM NaCl溶液统一灌溉进行盐胁迫处理。在灌溉后0、3、6、12和24小时收集叶和根样本。每个时间点收集三个生物学重复，每个重复包含来自五株单独幼苗的混合样本。所有收获的样品立即在液氮中冷冻，随后储存在-80°C直至进一步分析。
2.9. RNA提取与基因表达分析
使用RNA提取试剂盒从每个样本中分离总RNA。使用NanoDrop分光光度计评估RNA的浓度和纯度。然后使用HiScript III RT SuperMix进行第一链cDNA合成。对于实时定量PCR分析，选择泛素基因作为内参。反应在QuantStudio 5实时PCR系统上进行，使用ChamQ Universal SYBR qPCR预混液。所有反应均进行三次技术重复以确保技术可重复性。使用2?ΔΔCt方法计算基因相对表达水平。使用SPSS进行统计分析。通过单因素方差分析评估处理组之间的差异，随后进行Tukey HSD事后检验进行多重比较。小于0.05的概率值被认为具有统计学显著性。所有图形表示均使用GraphPad Prism生成。本研究中使用的引物序列的详细信息在补充材料中提供。
3. 结果
3.1. ZjNHX基因家族的鉴定与理化性质分析
在酸枣基因组中，本研究鉴定了8个ZjNHX基因家族成员，分布在6条染色体上。根据其线性染色体位置，这些基因被命名为ZjNHX1至ZjNHX8。理化表征显示其蛋白质性质存在显著差异。ZjNHX蛋白的长度从207个氨基酸到1145个氨基酸不等，分子量跨度从22.47 kDa到126.83 kDa。理论等电点在5.35到8.75之间变化，而不稳定指数范围从31.40到42.52。亲水性总平均值均为正值，表明ZjNHX蛋白通常是疏水性的，这与NHX作为跨膜Na+/H+交换器的生化功能一致。亚细胞定位预测表明，ZjNHX1–ZjNHX5和ZjNHX8很可能位于液泡，而ZjNHX6和ZjNHX7被预测位于质膜。跨膜螺旋预测证实大多数蛋白含有9-12个跨膜结构域，这与它们作为膜结合转运蛋白的作用一致；然而，ZjNHX4独特地只有4个跨膜结构域。
ZjNHX蛋白的二级结构表明，α螺旋和无规则卷曲在这些蛋白中占主导地位，比例分别在43.29%到62.30%、23.72%到39.32%之间。此外，为了进一步分析其结构特征，我们使用SWISS-MODEL预测并可视化了三维结构。这些模型揭示了保守的结构框架，为功能相似性提供了结构基础。
3.2. 系统发育分析
为了阐明ZjNHX蛋白的进化关系，本研究基于来自酸枣和其他九个物种的99个NHX蛋白序列构建了系统发育树。根据系统发育树，99个NHX蛋白聚为三个不同的分支，这与之前在拟南芥AtNHX蛋白中的发现一致。根据AtNHX蛋白的既定分类，这三个分支被命名为液泡(Vac)类、内体(Endo)类和质膜(PM)类。系统发育分析显示，Vac分支包含最多的NHX蛋白，其次是Endo分支，而PM分支成员最少。在酸枣中，ZjNHX蛋白也被分为三组。具体而言，ZjNHX6和ZjNHX7位于PM分支内，ZjNHX2位于Endo分支中，其余五个ZjNHX蛋白均分布在Vac分支中。值得注意的是，在Vac分支内，这四个ZjNHX蛋白与来自石榴、胡杨、葡萄和西葫芦等双子叶植物的NHX同源物相比，与来自水稻和小麦等单子叶植物的同源物进化亲缘关系更近。这种模式在Endo和PM分支中同样存在，表明NHX蛋白在双子叶植物中具有共同的进化轨迹。
3.3. 外显子-内含子分析与基序组成
为了深入探究酸枣ZjNHX基因的结构特征和进化关系，本研究对八个ZjNHX蛋白进行了系统发育分析、保守基序分析和基因结构分析。这张组合图显示了NHX基因家族的特征。系统发育树的结果表明，所有成员可分为三个主要分支，这与上述系统发育分析一致。ZjNHX蛋白的保守基序分布与系统发育树一致。因此，同一分支内的ZjNHX成员表现出相似的保守基序组成。具体来说，基序4、3和1主要出现在Vac分支中，而基序6、9和10主要出现在PM分支中。基于InterPro数据库的功能注释显示，基序1、2和3对应于Na+/H+交换结构域内的保守区域，广泛分布在Vac和Endo分支中。有趣的是，基序3包含阿米洛利结合位点，这是液泡NHX蛋白的特征性基序，在PM分支中不存在。多序列比对进一步证实了这一结果。基因结构分析进一步揭示，同一组内的基因在其遗传结构，特别是外显子和内含子的数量和长度方面具有相似性。结果显示，Vac分支中的蛋白大多拥有12到14个外显子。相比之下，该分支中的ZjNHX4表现出明显简化的构型，仅包含六个外显子，这一趋势与其保守基序数量减少一致。Endo分支中的ZjNHX2包含22个外显子。在PM分支中，ZjNHX6和ZjNHX7都包含23个外显子，结构最为复杂。总的来说，这种基因结构分析证实了系统发育分析建立的分类，并表明同一进化分支的成员在保守基序组成和外显子数量方面表现出高度的结构保守性。
3.4. 复制事件、共线性和选择压力分析
基因复制事件是基因组进化和基因家族扩张的主要驱动力。因此，我们分析了酸枣ZjNHX基因家族内的复制事件。结果表明，ZjNHX基因家族的进化是由各种类型的基因复制驱动的。具体而言，ZjNHX1、ZjNHX2和ZjNHX4起源于分散复制，而ZjNHX3、ZjNHX5和ZjNHX8是全基因组复制或片段复制的产物，而ZjNHX6和ZjNHX7则来自串联复制。此外，我们在酸枣基因组中鉴定了两个同线性基因对：ZjNHX5-ZjNHX3和ZjNHX5-ZjNHX8，分别位于9号、2号和12号染色体上。这种空间排列为其通过片段复制事件起源提供了额外支持。为了进一步研究作用于这些基因的进化约束，我们首先评估了所有同线性基因对的替换饱和度。在所有成对比较中，替换饱和度指数显著低于临界值，表明没有显著的饱和，从而支持了用于后续分化时间估计的Ks值的可靠性。基于此验证，我们计算了这些同源基因对的非同义与同义替换率比值。所有配对得到的Ka/Ks比值均显著小于1，为进化过程中强烈的纯化选择提供了明确证据。这种选择模式可能作用于保护NHX基因家族的关键功能结构。此外，分化时间估计显示，这些同源基因对是在不同的时间点通过片段复制形成的。ZjNHX5和ZjNHX3之间的分化发生在大约5541.1万年前，而ZjNHX5和ZjNHX8之间的分化发生得更早，大约在5922.8万年前。为了进一步阐明酸枣NHX基因家族的进化动态，我们在酸枣与模式植物拟南芥和水稻之间进行了种间同线性分析。结果显示酸枣与拟南芥之间有5个同线性基因对，酸枣与水稻之间有4个基因对。与拟南芥同线性基因对数量较多，可能源于它们更近的亲缘关系，因为两者都是双子叶植物。
3.5. ZjNHX启动子的顺式元件分析
为了进一步探究酸枣ZjNHX基因的转录调控机制和潜在生物学功能，提取了每个ZjNHX基因起始密码子ATG上游2000 bp的启动子序列，并使用PlantCARE数据库进行分析。结果共揭示了52种类型的顺式作用调控元件，分为四个功能类别：光响应、胁迫响应、植物激素响应和生长
