《Genes》：High-Resolution Microbial Fingerprinting for Forensic Individual Identification: A Proof-of-Concept Study Integrating 2bRAD-M and Hierarchical Attention Network
Haoran Li,
Zhiyao Yu,
Zhijing Wu,
Yuxin Lin,
Tao Liu,
Yuli Liu,
Juan An,
Jing Zhao,
Yan Liu and
Haiyan Wang
+ 1 author
编辑推荐：
本研究利用免疫组学高通量测序技术，首次系统解析了中国地方保护猪种——荣昌猪（RC）及其他四种纯种猪的抗体（Ab）组库特征。研究不仅证实了猪抗体组库对核心IGHV基因的保守偏好，更颠覆了传统认知，在全部受试猪种中均检测到低频率表达的IGHJ3，表明猪IGHJ基因的功能并非单一。研究还发现荣昌猪在抗体组库多样性、IGHV/IGHD基因使用偏好、VJ重组模式及HCDR3长度分布上均展现出独特的品种特异性。该成果为深入理解荣昌猪的免疫遗传特性、挖掘其抗病育种潜力、以及有效利用其遗传资源提供了关键的基因组学依据。
引言：地方猪种的免疫组学空白
猪不仅是重要的经济畜种，也是研究抗体（Ab）组库个体发生学的理想模型。与人类胎盘不同，猪的胎盘为上皮绒毛膜型，可阻断免疫球蛋白（Igs）等大分子向胎儿的被动转移，这使得新生仔猪成为研究不受母源抗体影响的Ab组库发育的绝佳系统。中国的地方猪种构成了宝贵的遗传资源库，其中荣昌（RC）猪以其强大的适应性、良好的抗病性和优良的肉质被列为国家级保护品种。然而，尽管其生态和农业意义重大，但关于荣昌猪抗体组库的特征仍不清晰，相关研究长期集中于约克夏、长白及其杂交猪，这限制了对猪免疫系统多样性的全面认知。本研究旨在填补这一空白，利用免疫组学高通量测序技术，首次系统比较了荣昌猪与其他四个代表性猪种（巴马（BM）猪、长白猪、杜洛克猪、约克夏猪）的抗体组库特征。
结果
1. 抗体组库高通量测序平台的建立
研究选取五种健康纯种猪，针对其B细胞受体（BCR）重链设计多重PCR引物，通过免疫组学高通量测序分析其抗体组库。数据质量分析显示，所有猪种的过滤效率均超过93%，且目标序列（VDJ片段）覆盖度达到50%，证明了实验数据的高质量和可比性。值得注意的是，荣昌猪显示出最低的CDR3序列占比（72.16%），暗示其可能存在品种特异性的V(D)J重组偏好。
2. IGHV、IGHD、IGHJ基因片段使用的品种特异性差异
猪IGH基因座包含5个IGHJ、4个IGHD和15个IGHV基因片段。分析发现，五个猪种均强烈偏好使用四个核心IGHV基因（IGHV1S2、IGHV1-15、IGHV1-4和IGHV1-14），其总使用频率在69%至82.5%之间。其中，荣昌猪的IGHV1S2使用频率最高，而IGHV1-4使用频率最低。
在IGHD基因中，IGHD1和IGHD2是五个猪种中使用频率最高的两个基因，合计使用率超过75%。相比之下，荣昌猪对低频使用的IGHD3和IGHD4的使用频率最高。
最令人意外的发现是，传统观点认为猪的五个IGHJ基因中仅有IGHJ5具有功能。然而，本研究发现，所有五个猪种不仅大量使用IGHJ5（>99.0%），还检测到低频率表达的IGHJ3（0.2%-0.8%），其中荣昌猪的IGHJ3使用频率最低。这一发现挑战了关于猪抗体组库中IGHJ基因功能的既有认知。
3. 不同猪种间IgH VJ重组多样性分析
V(D)J重组是B细胞成熟过程中产生抗体多样性的核心机制。研究分析了不同猪种的IGH VJ重组多样性。结果表明，荣昌猪倾向于使用特定的VJ组合，如(IGHV1S2)-IGHJ5、(IGHV1-15)-IGHJ5和(IGHV1-4)-IGHJ5。更重要的是，所有猪种都使用了不同比例的IGHV-IGHJ3组合，尽管其比例均低于0.3%。这表明IGHJ3确实参与了V(D)J重排，只是其功能利用非常微弱，且存在品种间的差异。
4. 不同猪种IGH CDR3氨基酸长度分布
重链互补决定区3（HCDR3）是抗体-抗原（Ag）结合的核心区域，其长度分布是评估抗体组库多样性的重要指标。研究发现，荣昌猪的抗体组库容量（1,294,939）仅次于长白猪，表明其抗体库具有更丰富的潜在抗原结合特异性，是筛选猪源抗体的优质候选。
在HCDR3长度分布上，荣昌猪和巴马猪表现出相似的高斯分布，平均长度约为15.00个氨基酸（aa）。而三个商业猪种（长白、杜洛克、约克夏）的平均长度约为16.00 aa。统计比较显示，荣昌猪与商业猪种在4-13 aa短HCDR3和14-28 aa长HCDR3的序列比例上存在极显著差异，而与巴马猪无显著差异。这表明商业猪种具有更大的HCDR3长度多样性潜力，而地方猪种（RC和BM）可能更倾向于产生HCDR3区域更短或结构独特的抗体。
讨论
本研究通过高通量测序揭示了猪抗体组库基因使用的复杂图景。在IGHV基因使用上，荣昌猪表现出显著的特异性，尤其是对IGHV1S2的高度偏好和对IGHV1-4的低度使用，这反映了其独特的免疫应对策略。IGHD1和IGHD2作为核心功能基因在所有猪种中保守使用，而荣昌猪对IGHD3和IGHD4的更高频率使用，则可能与其长期适应特定地方病原体和环境压力有关，以此增强抗体多样性。
本研究的突破性发现在于，通过超高深度测序，在所有猪种中均检测到低频率表达的IGHJ3。这颠覆了此前“猪仅使用功能性的IGHJ5”的结论，表明在猪的抗体组库形成过程中，IGHJ3同样被“弱功能性”利用。其中，荣昌猪的IGHJ3使用频率在所有猪种中最低，这可能揭示了其独特的免疫组库重组调控机制。同时，所有猪种均存在IGHV-IGHJ3组合，进一步证实了猪V(D)J重组机制的复杂性远超以往认知。
荣昌猪的抗体组库容量大，但CDR3序列比例低，且VJ组合偏好独特，这些共同表明其形成了独特的免疫组库重组模式。其HCDR3长度分布特征也区别于商业猪种，显示出品种特异性的免疫遗传背景。
结论
综上所述，本研究首次系统解析了中国地方猪种荣昌猪的抗体组库特征，并与商业猪种进行了全面比较。研究不仅发现了IGHV、IGHD基因使用的保守与特异性模式，更重要的是，挑战了猪IGHJ基因功能的传统观点，证实了低频率IGHJ3的存在。荣昌猪在抗体组库多样性、基因使用偏好、VJ重组模式和CDR3特征上均展现出鲜明的品种特异性。这些发现不仅填补了中国地方猪种免疫组学研究的空白，也为后续深入探究荣昌猪在不同免疫状态下V(D)J重排抗体组库特异性变化的调控机制、挖掘其抗病育种潜力、以及实现其遗传资源的有效利用奠定了坚实的分子基础。
