引言
痴呆症患病率的上升构成了重大的社会挑战。阿尔茨海默病（AD）约占所有痴呆病例的70%，其进展缓慢，以大脑中β-淀粉样蛋白（Aβ）肽的积累和tau蛋白的过度磷酸化为特征，最终导致脑神经细胞及其连接的损伤。在Aβ肽中，Aβ42疏水性强且易形成淀粉样蛋白，其水平升高与淀粉样斑块的形成密切相关。有趣的是，研究表明，缺乏肠道微生物的无菌小鼠大脑中不会出现Aβ积累，这进一步支持了脑-肠轴在神经退行性疾病中的作用。
最近有报道称，将AD患者的粪便移植到健康大鼠体内，会通过改变与神经发生和认知功能相关的盲肠代谢物表达，从而导致这些大鼠患上AD。此外，将年轻小鼠的粪便移植给老年小鼠，可改善后者的认知功能和免疫力。其中特别令人关注的是肠道细菌梭菌目（Clostridiales），它能产生一种与人类Aβ肽高度同源的Aβ样肽，共享相似的三级结构和Aβ42样活性。来自各种小鼠模型的实验证据表明，菌群失调可能导致肠道屏障的破坏，从而使Aβ肽、脂多糖（LPS）和细菌代谢物进入血液，穿过血脑屏障，并积聚在大脑中，最终导致痴呆症状。AD的发病机制被认为不仅涉及大脑Aβ，还包括炎症、代谢副产物和免疫信号等次要因素，共同塑造疾病状态。有证据表明，肠道是人类大脑Aβ的重要来源。综上所述，这些发现表明肠道细菌有助于大脑中Aβ的积累，进而参与AD的病理生理学。
尽管已有许多研究评估了AD中的肠道微生物群，但对肠道菌群组成的地理差异研究甚少。考虑到饮食对肠道微生物群的影响，可以合理地推测，具有特定饮食习惯的地理区域可能导致特征性的微生物群组成。例如，与典型的西方饮食不同，日本饮食包括发酵食品、高纤维和海鲜。然而，针对日本人群在健康和疾病状态下肠道微生物群组成的研究文献仍然很少。因此，本研究调查了日本人（包括健康受试者和AD患者）的肠道微生物群组成。具体而言，我们假设人类肠道微生物群可能包含某些促进Aβ产生的细菌（即有助于AD发病的细菌）和另一些抑制Aβ积累的细菌（即缓解AD进展的细菌）。
材料与方法
本研究是一项探索性研究，在Akirudai医院进行。样本收集和检测在2023年4月1日至5月20日期间进行。研究包括在此期间被诊断为AD并提供知情同意书的所有患者。该组包括21名22-79岁的健康成年人（平均年龄：40.6岁；9名男性和12名女性）和10名78-92岁的AD患者（平均年龄：83.7岁；3名男性和7名女性）。健康成年人（HA）根据年龄进一步细分为三组：HA-1（7名≤30岁的参与者；5名男性和2名女性），HA-2（4名31-40岁的参与者；3名男性和1名女性），以及HA-3（10名≥41岁的参与者；4名男性和6名女性）。这使我们能够研究不同年龄段的微生物组组成，所选年龄范围区分了年轻人、成年人和中老年参与者。所有参与者都提供了参与研究的书面知情同意书，包括样本收集和检测。
健康参与者的纳入标准为同意参与、无已知疾病、保持均衡饮食（根据日本膳食指南陀螺定义）且未服用可能影响肠道微生物群的药物的门诊非AD患者。通过问卷评估饮食，该问卷仅用于参与者的筛选和排除。收集了全面的用药史，包括处方药、非处方药和膳食补充剂。健康参与者的排除标准包括：在入组前6周内使用过任何抗生素，前4周内使用过质子泵抑制剂或其他抑酸剂，前2周内使用过益生菌或益生元，以及使用过其他预计会显著影响肠道微生物群的药物（例如，免疫抑制剂、糖皮质激素、胆汁酸螯合剂）。如果历史上使用过此类药物，则需要洗脱期，并在样本收集前记录最短2周（短效）或更长（视情况而定）的洗脱期。AD患者和健康对照者如果患有合并症、有吸烟史或饮食不耐受，则被排除。此外，各组的BMI相似。
对于AD参与者，纳入标准要求由痴呆症专家正式诊断为AD，并同意参与。排除标准包括：（a）在入组前6周内使用过抗生素，（b）在规定的洗脱期内持续接受已知会显著影响肠道菌群的药物治疗（例如，质子泵抑制剂、免疫抑制剂、皮质类固醇或上述其他药物），以及（c）饮食不耐受。
所有AD参与者均来自Akirudai医院神经内科的门诊患者。一位拥有30年痴呆诊断经验的专家根据既定的AD诊断标准进行评估，包括智力和认知功能测试，如简易精神状态检查（MMSE），以及神经心理学评估。进行了影像学研究，包括计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）或淀粉样蛋白正电子发射断层扫描（PET），以确认大脑和海马体萎缩以及Aβ积累。所有患者都接受了所有检查。
饮食和药物调查方面，使用简短的自我管理饮食史问卷评估饮食习惯，旨在排除具有非典型饮食习惯的参与者。还对可能影响肠道微生物群组成的口服药物的使用情况进行了调查。在获得每位捐赠者的口头和书面知情同意后，根据《赫尔辛基宣言》概述的伦理原则进行粪便采样。该研究方案获得了Akirudai医院伦理审查委员会的批准。
粪便微生物群分析方面，使用市售的粪便采集试剂盒收集粪便样本，并分发给参与者，附有详细的收集说明。指示参与者将样品在4°C下储存直至送至医院，并提供了一个带冰袋的运输容器。使用扩增子测序、热图层次聚类和多样性分析对收集的粪便样本中的细菌菌群进行分析。
扩增子测序分析方面，从粪便样本中提取的DNA根据Takahashi等人的方法进行预处理，并使用自动分离器纯化粗DNA。使用引物组进行PCR扩增，靶向细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。在此步骤中，将每个样品独有的索引序列插入每个引物。使用MiSeq和MiSeq试剂盒v3进行配对末端测序。
扩增子测序数据分析方面，使用Cutadapt修剪配对末端测序读数上的引物序列。使用fastq-join程序合并配对末端测序读数。仅保留质量分数≥20的合并读数。使用数据库进行序列分类。对于多样性分析，通过QIIME2处理合并的扩增子序列读数。进行质量过滤和嵌合序列删除，然后使用DADA2创建代表性序列。将样本稀释至每个样本至少19,180个序列，并计算Alpha多样性指数和Beta多样性度量。还使用R中的库进行了二维主坐标分析。通过Kruskal-Wallis检验评估各组之间Alpha多样性指数的统计学显著性。通过ANOSIM检验评估组间细菌群落相似性的统计学显著性。
使用统计分析软件R进行数据分析，利用微生物鉴定数据库中估计的物种级分类群，识别与AD和健康参与者相关的细菌物种。此外，分析了特定分类群的组成，包括在之前的研究中发现存在显著组间差异的属、科和目。使用R软件基于提取的物种组成比的分组信息生成箱线图。使用R中的vegan包进行Mann-Whitney U检验进行统计比较。评估每个细菌物种的比例在研究组之间是否存在显著差异。为了控制假阳性率，使用Bonferroni方法校正p值。统计学显著性设定为p < 0.05。
结果
在四组（AD、HA-1、HA-2和HA-3）之间未发现细菌组成的显著差异。尽管如此，某些细菌物种在AD组中更常见，而其他物种似乎在健康成人中占主导地位（p > 0.05）。在HA亚组（HA-1、HA-2和HA-3）之间也发现了组成差异，同样不显著（所有p > 0.05），但Bacteroides uniformis和Mediterraneibacter gravus是例外，它们分别在HA-2和HA-3之间以及AD和HA-3之间具有临界显著性（p = 0.05）。
因此，Ruminococcus torques和Roseburia inulinivorans倾向于在AD个体中占主导，而Agathobacter rectalis、Bacteroides uniformis、Blautia wexlerae和Clostridium butyricum则在健康个体中占主导。这可由文中图片展示：以及 0.05 (Mann–Whitney U test); AD: participants with Alzheimer’s disease (n = 10); HA-1: healthy participants aged ≤30 years (n = 7); HA--2: healthy participants aged 31–40 years (n = 4); HA-3: healthy participants aged ≥41 years (n = 10)."> 和 0.05 (Mann–Whitney U test); AD: participants with Alzheimer’s disease (n = 10); HA-1: healthy participants aged ≤30 years (n = 7); HA-2: healthy participants aged 31–40 years (n = 4); HA-3: healthy participants aged ≥41 years (n = 10)."> 辅助说明。
热图层次聚类分析和多样性分析的结果表明，AD组和健康成人组之间的细菌菌群多样性存在差异，在Bray-Curtis热图中，AD与HA-2、AD与HA-3、以及HA-1与HA-3之间发现了显著差异，而HA-2与HA-3之间具有临界显著性。在加权或非加权UniFrac热图中未发现显著差异。
讨论
在这项探索性研究中，我们调查了日本队列中肠道微生物群在AD发病机制中的作用。尽管我们的发现是探索性的，基于小样本量，这可能是缺乏统计学显著性的原因，但它们表明AD组中几种肠道细菌物种占优势，而其他物种在健康成人中占优势。最近，脑-肠轴因其在神经系统疾病中的作用而受到越来越多的关注，先前的研究已经证明了肠道微生物群对AD的影响。我们的发现可能通过提供日本患者中这种关联的初步数据来补充这一证据。因此，我们的研究可能是更好地理解种族对脑-肠轴及其在神经退行性疾病中作用影响的起点。
在AD组中似乎更丰富的一个物种是R. inulinivorans。这种细菌是主要梭菌簇XIVa组的代表，该组已知在生长过程中利用厌氧多糖产生丁酸。在AD患者中也更常见的R. torques是粘蛋白2（结肠细胞表面粘蛋白的关键成分）最有效的降解者。R. torques活性引起的肠道通透性增加与AD发病机制有关。R. torques还通过产生次级胆汁酸来抑制肠道炎症。丁酸是某些肠道细菌产生的短链脂肪酸，通常被认为能促进粘蛋白产生，加强粘膜层并支持肠道屏障功能。此外，丁酸增加三叶因子家族肽的表达，这些肽有助于肠粘膜的维持和修复，并增强结肠上皮细胞中紧密连接的表达。
然而，丁酸对肠道屏障的影响是复杂且浓度依赖性的。中等浓度的丁酸增强肠道屏障功能，而过高的浓度可诱导结肠上皮细胞凋亡，破坏肠道屏障，并可能促进结直肠癌和其他疾病。丁酸在维持肠道屏障完整性中的确切作用仍未完全了解，值得进一步研究。但是，鉴于我们的初步发现，可以推测在AD患者中发现的更高数量的R. inulinivorans可能导致更高水平的丁酸，从而促进AD的发病机制。
由于伴随Aβ积累引起的神经元损伤和线粒体功能障碍，AD痴呆的治疗仍然具有挑战性。Lecanemab是一种旨在降解积累的Aβ的新型单克隆抗体，已被开发为AD的治疗方法；另一种单克隆抗体donanemab也在2期临床试验中进行了评估，发现其在76周时改善了认知和日常生活活动能力，最近已被批准用于临床。尽管这两种疗法可能减缓AD痴呆的进展，但它们并不能治愈。值得注意的是，目前尚无AD的治愈性疗法。因此，早期筛查轻度认知障碍（MCI）和AD对于防止进展为AD痴呆至关重要。
先前的研究已经提出了通过测量血浆Aβ水平来筛查MCI和早期AD的潜力。然而，尚未建立识别临床前AD个体的有效筛查方法。在2型糖尿病的临床病例中，肠道细菌在维持体内平衡直至发生菌群失调方面起着关键作用，一些作者已经提出通过分析肠道细菌的动态来预测2型糖尿病发病的潜力。类似地，已观察到肠道微生物群组成和功能的变化先于AD的发病，这表明分析肠道微生物群可能是识别AD高风险个体的有用方法。Al Kuraishy等人的一篇近期综述强调了钙卫蛋白作为帕金森病诊断和预后生物标志物的潜在价值，基于其与菌群失调的关联。因此，有必要进行进一步的研究来评估其作为AD生物标志物的价值。肠道微生物群的这些变化可在血液标志物改变之前被检测到。
在人类中，Aβ大约在40岁时开始在大脑中积累，MCI和AD的发病大约在20年后。在AD发病之前的这个中间时期，认知功能似乎正常。最近使用实验小鼠模型的研究表明，肠道细菌产生Aβ，Aβ进入血液，穿过血脑屏障，并积聚在脑组织中，最终导致痴呆。此外，新出现的证据表明，肠道是人类大脑Aβ的重要来源。除了在大脑中积累，Aβ还可以通过紊乱的血脑屏障被转运到体循环，并可能积聚在心脏中，可能导致心力衰竭。尽管肠道微生物群变化与脑部疾病之间的确切关系尚不清楚，但通过脑-肠轴调节痴呆病理学已成为一个日益突出的研究领域。
细菌生态学和功能的许多方面仍然知之甚少。细菌可以通过与宿主或环境的相互作用获得遗传物质，表现出新的功能，包括那些由水平基因转移（HGT）事件产生的功能。HGT的一个典型例子是细菌获得抗生素抗性。在多发性硬化症（MS）中，这是一种受环境因素影响并与AD共享一些神经退行性途径的自身免疫性脱髓鞘疾病，据报道HGT塑造了某些细菌的致病性。上述一些细菌遗传信息很可能因HGT事件而改变。
HGT分析无法通过鸟枪法宏基因组学进行，但长读长宏基因组学能够精确分析细菌染色体，使其成为研究HGT的有价值工具。长读长宏基因组学可以同时检测和可视化多个细菌物种染色体中的HGT事件，促进细菌的详细功能分析，包括质粒和噬菌体相互作用。
我们假设，本研究中报道的可能与AD痴呆相关的细菌物种可能具有Aβ生成特性。为了探索这一假设，我们计划使用长读长宏基因组学全面分析每种肠道细菌的功能基因，这将允许更详细地了解其在AD发病机制中潜在作用的遗传机制。
我们还研究了在健康成人中相对更丰富的肠道细菌的功能。C. butyricum和A. rectalis是产生丁酸的细菌，有助于肠道屏障完整性和抗炎作用。B. wexlerae产生代谢物，如鸟氨酸、乙酰胆碱和S-腺苷甲硫氨酸，这些代谢物抑制脂肪积累，并与其他肠道细菌协同作用以改善肠道环境，可能预防或减轻肥胖和糖尿病。
尽管各种细菌物种已显示出抗炎、抗肥胖和糖酵解作用，但只有B. breve和A. butyriciproducens被报道可预防痴呆。我们假设上述细菌物种也可能表现出抗痴呆或Aβ分解作用。为了研究这一假设，我们计划使用长读长序列宏基因组学进行全面的肠道微生物群基因分析。
分析肠道细菌的功能作用必须考虑其代谢物的影响。虽然基因组分析提供了对细菌遗传能力的洞察，但代谢组分析对于理解细菌功能同样重要。
影响肠道微生物群组成的因素包括性别、饮食习惯和药物。其中，饮食习惯和口服药物尤为重要。纳入元数据作为混杂因素的多变量分析表明，胃肠道药物、抗糖尿病药物、抗生素、抗血栓形成剂、心血管和脑部疾病治疗以及抗癌药物等药物对肠道微生物群的影响最为显著。具体而言，质子泵抑制剂、钾通道酸阻滞剂、渗透性泻药、氨基酸和胆汁酸抑制剂在胃肠道药物中具有强烈影响，而α-葡萄糖苷酶抑制剂在抗糖尿病药物中具有显著影响。
Nagata等人也报告说，多药给药增加了机会性病原体在共生细菌中的数量，并减少了产生短链脂肪酸（SCFA）的物种，如丁酸和乙酸。在我们的研究中，尽管一些参与者正在服用抗高血压药物，但没有人服用已知会强烈影响肠道微生物群的药物或多药同时服用。此外，所有参与者均未表现出饮食偏差。
这项探索性研究首次提供了对日本受试者肠道微生物群组成的初步了解。需要进行进一步的纵向研究，以更好地了解这种组成如何随时间变化。我们确定了倾向于在AD组中相对更丰富的细菌物种，以及其他在健康成人中相对更丰富的细菌物种。如果我们的初步发现能够得到更大规模研究的证实，这将表明在AD患者和健康对照之间存在一个中间群体。这个中间群体，被称为“AD储备组”，可能代表痴呆发病风险较高的个体。然而，这一假设需要在未来的大规模临床试验中得到验证。基于这些发现，需要对饮食操纵和使用益生菌等预防策略进行进一步研究，最终促成AD预防项目的实施。目前，我们正在考虑使用本研究中确定的细菌物种进行AD预防项目。
此外，下一步将是考虑使用人工智能来分析与AD发病（P）相关的细菌物种和与AD抑制（S）相关的细菌物种的比例（P/S）。如果得到验证，关于P/S比率从健康到临床前AD再到MCI/AD分阶段增加的假设，将能够对临床前AD群体进行严格诊断。这种方法有潜力成为一种突破性的临床前AD筛查诊断工具。此外，通过痴呆保护性食物改善肠道微生物群的组成，或将AD抑制细菌移植到临床前AD组的个体中，可以作为预防AD的策略。在此背景下，需要进行更大规模的研究，包括年龄和性别具有代表性的人群，以验证临床前AD状态。
此外，检查摄入抗痴呆食物和食品成分前后与AD和非AD状态相关的细菌动态，可以促进对其认知效果的严格评估。此类研究还可以促进新型抗痴呆食物和成分的开发，进一步有助于AD预防策略。
本研究存在一些局限性。首先，由于这是一项单中心研究，仅涉及31名参与者，研究的统计功效和普遍性有限。需要进行更大规模、多中心、基于正式功效分析前瞻性确定样本量的研究来验证这些发现。考虑到样本量，本研究是假设生成性的，而非确认性的。其次，健康成年人群（35.3岁）的平均年龄远低于AD人群，这一点尤其相关，因为肠道微生物组组成随着年龄增长而逐渐变化。为了解决这一局限性，我们纳入了三个不同年龄段的健康成人组，并分析了微生物群组成的潜在年龄相关差异。然而，小样本量很可能阻碍了统计学上显著差异的检测，使得我们的研究具有假设生成性而非确认性，因此强调了进行更大规模研究的必要性。第三，虽然我们的研究结果表明特定细菌物种与AD之间存在潜在关联，但它们并未确立因果关系。需要未来的纵向或干预性研究来评估时间变化和因果关系；采用更深度的测序方法（例如，鸟枪法宏基因组学、宏转录组学）以获得更高的分类学分辨率和功能洞察；整合多组学（代谢组学）以将分类群与代谢物和宿主反应联系起来。
结论
对健康个体和AD患者粪便细菌的分析，在日本队列中鉴定出了可能与AD状态和非AD状态存在差异关联的人类肠道微生物群中的细菌物种。这些发现与其他种族中观察到的模式一致，为肠道微生物群作为AD预防中可调节因素的潜力提供了有希望的见解，并可能为该人群的风险分层和预防提供一种无创途径。然而，该研究的探索性质使得这些发现是假设生成性的，而非确认性的，考虑到小样本量、年龄不匹配的组别以及无法解决个体间差异。这强调了需要进行大规模的临床试验，并使用先进的宏基因组学技术对这些细菌物种进行详细的功能分析，以验证这些观察结果。
此外，考虑到通过补充剂重建肠道微生物群的可能性，需要进行长期的干预性研究，以评估改变肠道微生物组是否能够影响发展AD的风险，特别是在高危人群中。此类研究将极大地促进AD新型预防策略和干预措施的发展。
