1. 引言
痴呆症日益增长的患病率构成了重大的社会挑战。其中，阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）约占所有痴呆病例的70%。该病进展缓慢，其特征是大脑中淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）肽的积累和tau蛋白的过度磷酸化，从而导致脑神经细胞及其连接的损伤。在Aβ肽中，Aβ42具有高度疏水性和淀粉样变性，其水平升高与淀粉样斑块的形成密切相关。有趣的是，研究表明缺乏肠道微生物群的无菌小鼠不会出现大脑中的Aβ积累，这进一步支持了脑-肠轴在神经退行性疾病中的作用。
最近有报道称，将AD患者的人类粪便移植到健康大鼠体内，会通过改变涉及神经发生和认知功能的盲肠代谢物表达，导致这些大鼠患上AD。另一项研究发现，将年轻小鼠的粪便移植到老年小鼠体内，可改善后者的认知功能和免疫力。其中，肠道细菌梭菌目（Clostridiales）尤其值得关注，它能产生一种与人类Aβ肽具有高度同源性的Aβ样肽，两者具有相似的三级结构和Aβ42样活性。来自不同小鼠模型的实验证据表明，菌群失调可能导致肠道屏障的破坏，从而使Aβ肽、脂多糖（LPS）和细菌代谢产物进入血液，穿过血脑屏障，并积聚在大脑中，最终导致痴呆症状。AD的发病机制被认为不仅涉及大脑Aβ，还包括炎症、代谢副产物和免疫信号传导等次要因素，它们共同塑造了疾病状态。有证据表明，肠道是人类大脑中Aβ的重要来源。综上所述，这些发现表明肠道细菌有助于大脑中Aβ的积累，从而参与了AD的病理生理学。
尽管已有大量研究评估了AD中的肠道微生物群，但关于肠道菌群组成的地理差异研究甚少。考虑到饮食对肠道微生物群的影响，可以合理推测具有特定饮食习惯的地理区域可能会形成特征性的微生物群组成。例如，与典型的西方饮食不同，日本饮食包括发酵食品、高纤维和海鲜。然而，探讨日本人群在健康和疾病状态下肠道微生物群组成的文献仍然很少。因此，本研究调查了日本人（包括健康受试者和AD患者）肠道微生物群的组成。具体而言，我们假设人类肠道微生物群可能包含某些促进Aβ产生的细菌（即有助于AD发病的细菌）和其他抑制Aβ积累的细菌（即减缓AD进展的细菌）。
2. 材料与方法
2.1. 参与者
这项探索性研究在Akirudai医院进行，样本收集和检测时间为2023年4月1日至5月20日。研究纳入了在此期间确诊为AD并签署知情同意书的所有患者。该队列包括21名22-79岁的健康成人（平均年龄：40.6岁；9名男性和12名女性）和10名78-92岁的AD患者（平均年龄：83.7岁；3名男性和7名女性）。健康成人（HA）根据年龄进一步细分为三组：HA-1（7名≤30岁的参与者；5名男性和2名女性）、HA-2（4名31-40岁的参与者；3名男性和1名女性）以及HA-3（10名≥41岁的参与者；4名男性和6名女性）。这使得我们能够研究不同年龄段的微生物组组成，所选的年龄范围区分了年轻人、成年人以及中老年参与者。所有参与者都提供了参与研究的书面知情同意书，包括样本收集和检测。
2.2. 纳入与排除标准
健康参与者是同意参加、无已知疾病、保持均衡饮食（依据日本食物指南“陀螺”定义）且未服用可能影响肠道菌群药物的门诊患者。饮食通过问卷评估，该问卷仅用于参与者的筛选和排除。收集了全面的用药史，包括处方药、非处方药和膳食补充剂。健康参与者的排除标准包括：前6周内使用过任何抗生素、前4周内使用过质子泵抑制剂或其他抑酸剂、前2周内使用过益生菌或益生元，以及预计会显著影响肠道微生物群的其他药物（如免疫抑制剂、糖皮质激素、胆汁酸螯合剂）；如果历史上使用过此类药物，则需要洗脱期，并在样本收集前记录至少2周（短效）或更长（视情况而定）的洗脱期。AD患者和健康对照组均因合并症、吸烟史或饮食不耐受而被排除。此外，各组具有相似的BMI（AD：22.9 ± 1.10；HA-1：21.86 ± 1.21；HA-2：21.75 ± 0.96；HA-3：22.1 ± 1.10）。
对于AD参与者，纳入标准要求由痴呆症专家正式诊断为AD，并同意参与。排除标准包括：（a）前6周内使用过抗生素；（b）在指定洗脱期内，正在接受已知会显著影响肠道菌群的药物治疗（如PPI、免疫抑制剂、皮质类固醇或上述其他药物）；以及（c）饮食不耐受。
2.3. 阿尔茨海默病的诊断
所有AD参与者均来自Akirudai医院神经内科的门诊患者。一位拥有30年痴呆症诊断经验的专家根据已确立的AD诊断标准进行评估，包括智力、认知、执行和记忆功能测试，如简易精神状态检查（Mini-Mental State Examination, MMSE），以及神经心理学评估。进行影像学检查，包括计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）或淀粉样蛋白正电子发射断层扫描（PET），以确认大脑和海马萎缩以及Aβ积累。所有患者都接受了所有检查。MMSE的结果见Table 1。
2.4. 饮食与用药调查
强烈影响肠道菌群组成的饮食习惯，通过一份简短的自我管理饮食史问卷进行评估，旨在排除饮食习性不典型的参与者。参与者还被调查了可能影响肠道菌群组成的口服药物使用情况。
粪便采样是在获得每位捐赠者的口头和书面知情同意后进行的，符合《赫尔辛基宣言》中概述的伦理原则。研究方案获得了Akirudai医院伦理审查委员会的批准。
2.5. 粪便微生物群分析
使用市售粪便采集试剂盒收集粪便样本。向参与者分发了试剂盒以及详细的收集说明。参与者被要求在将样本送到医院之前将其储存在4°C，并提供了一个装有冰袋的运输容器。使用扩增子测序、热图层次聚类和多样性分析对收集的粪便样本中的细菌菌群进行分析。
2.6. 扩增子测序分析
从粪便样本中提取的DNA根据Takahashi等人描述的方法进行预处理，并使用GENE PREP STAR PI-480 DNA自动分离器纯化粗DNA。PCR扩增靶向细菌16S rRNA基因的V3-V4区域，使用引物组341f-R806，该方法根据Takahashi等人描述的方法扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4区域。在此步骤中，将每个样本特有的索引序列插入每个引物。使用MiSeq和MiSeq Reagent Kit v3进行测序，以2×301个循环进行双端测序。
2.7. 扩增子测序数据分析
使用Cutadapt软件修剪双端测序读段上的引物序列。使用fastq-join程序合并双端测序读段。仅保留质量得分≥20且覆盖序列超过99%的合并读段。使用usearch61删除嵌合序列。对于分类学鉴定，使用了TechnoSuruga实验室微生物鉴定数据库（DB-BA）。使用Metagenome@KIN分析软件确定与DB-BA数据库同源性≥97%的序列。
对于多样性分析，通过QIIME2处理合并的扩增子序列读段。进行质量过滤和嵌合序列删除，之后使用DADA2创建代表序列。将样本稀释至每个样本至少19,180条序列，并计算α多样性指数和β多样性距离度量。还使用R中的qiime2R和tidyverse库进行了二维主坐标分析。通过Kruskal-Wallis检验评估各组间Chao1、Shannon和Simpson指数的统计学显著性。通过ANOSIM检验评估组间细菌群落相似性的统计学显著性。
2.8. 使用统计分析软件R进行数据分析
使用微生物鉴定数据库中估计的物种级分类单元，识别了与AD和健康参与者相关的细菌物种。此外，分析了特定分类单元（包括在组间发现显著差异的属、科、目）的组成。使用R软件生成基于从提取的物种组成比率得出的分组信息的箱线图。
使用Mann-Whitney U检验进行统计学比较。评估了各细菌物种比例在研究组间的显著性差异。为控制假阳性率，使用Bonferroni方法校正p值。统计学显著性设定为p < 0.05。
3. 结果
在四组（AD、HA-1、HA-2和HA-3）之间未发现细菌组成的显著差异。尽管如此，某些细菌物种在AD组中更常见，而其他物种似乎在健康成人中占优势。在健康成人亚组（HA-1、HA-2和HA-3）之间也发现了组成差异，同样不显著，但Bacteroides uniformis和Mediterraneibacter gravus分别在HA-2和HA-3之间以及AD和HA-3之间呈现临界显著性。因此，Ruminococcus torques和Roseburia inulinivorans倾向于在AD个体中占优势，而Agathobacter rectalis、Bacteroides uniformis、Blautia wexlerae和Clostridium butyricum则在健康个体中占优势。
热图层次聚类分析和多样性分析的结果在补充材料中提供。总的来说，这些分析表明，细菌菌群的多样性在AD组和健康成人组之间存在差异，Bray-Curtis热图显示AD与HA-2之间、AD与HA-3之间以及HA-1与HA-3之间存在显著差异。在加权或非加权UniFrac热图中未发现显著差异。
4. 讨论
在这项探索性研究中，我们调查了日本队列中肠道微生物群在AD发病机制中的作用。尽管我们的发现是基于小样本量的探索性研究，这可以解释缺乏统计学显著性的原因，但它们表明了几种肠道细菌物种在AD组中占优势，而其他物种在健康成人中占优势。最近，脑-肠轴在神经系统疾病中的作用日益受到关注，先前的研究已经证明了肠道微生物群对AD的影响。我们的发现可能通过提供日本患者中这种关联的初步数据，为这一证据奠定了基础。因此，我们的研究可能是一个起点，有助于更好地理解种族对脑-肠轴及其在神经退行性疾病中作用的影响。
在AD组中似乎更丰富的物种之一是R. inulinivorans。这种细菌是主要梭菌簇XIVa组的代表，该组以其在生长过程中利用厌氧多糖产生丁酸而闻名。在AD患者中也更常见的R. torques，是黏蛋白2最有效的降解者，黏蛋白2是结肠细胞表面黏蛋白的关键成分。由R. torques活性引起的肠道通透性增加与AD发病机制有关。R. torques还通过产生次级胆汁酸来抑制肠道炎症。丁酸盐是某些肠道细菌产生的短链脂肪酸，通常被认为能促进黏蛋白产生、增强黏膜层并支持肠道屏障功能。此外，丁酸盐增加三叶因子家族肽的表达，这些肽有助于肠黏膜的维持和修复，并增强结肠上皮细胞中紧密连接蛋白的表达。
然而，丁酸盐对肠道屏障的影响是复杂且浓度依赖的。中等浓度的丁酸盐增强肠道屏障功能，而过高的浓度则可诱导结肠上皮细胞凋亡，破坏肠道屏障，并可能促进结直肠癌和其他疾病。丁酸盐在维持肠道屏障完整性中的确切作用仍未完全清楚，值得进一步研究。但是，鉴于我们的初步发现，可以推测在AD患者中发现的较高数量的R. inulinivorans可能导致丁酸盐水平升高，从而促进AD的发病机制。
由于伴随Aβ积累引起的神经元损伤和线粒体功能障碍，AD痴呆的治疗仍然具有挑战性。Lecanemab是一种旨在降解积累的Aβ的新型单克隆抗体，已被开发为AD的治疗方法；另一种单克隆抗体donanemab也在2期临床试验中进行了评估，发现在76周时能改善认知和日常生活活动能力，并最近获批用于临床。尽管这两种疗法可能减缓AD痴呆的进展，但它们不能治愈。值得注意的是，目前尚无AD的治愈性疗法。因此，对轻度认知障碍（MCI）和AD进行早期筛查对于防止进展为AD痴呆至关重要。
先前的研究提出了通过测量血浆Aβ水平来筛查MCI和早期AD的潜力。然而，目前尚无有效的方法来识别临床前AD个体。在2型糖尿病的临床病例中，肠道细菌在维持稳态方面起着关键作用，直到菌群失调发生，一些作者建议通过分析肠道细菌的动态变化来预测2型糖尿病的发病。类似地，已观察到肠道微生物群组成和功能的变化先于AD的发病，这表明分析肠道微生物群可能是一种识别AD高风险个体的有用方法。Al Kuraishy等人最近的一篇综述强调了钙卫蛋白作为帕金森病诊断和预后生物标志物的潜在价值，基于其与菌群失调的关联。因此，需要进一步研究评估其作为AD生物标志物的价值。这些肠道微生物群的变化可在血液标志物改变之前被检测到。
在人类中，Aβ大约在40岁左右开始在大脑中积累，MCI和AD的发病大约在20年后。在AD发病前的这个中间阶段，认知功能似乎正常。最近使用实验小鼠模型的研究表明，肠道细菌产生Aβ，进入血液，穿过血脑屏障，并在脑组织中积累，最终导致痴呆。此外，新出现的证据表明，肠道是人类大脑中Aβ的重要来源。除了在大脑中积累外，Aβ还可以通过紊乱的血脑屏障被转运到体循环，并可能在心脏中积累，可能导致心力衰竭。尽管肠道微生物群变化与脑部疾病之间的确切关系仍不清楚，但通过脑-肠轴调节痴呆病理已成为一个日益突出的研究领域。
细菌生态学和功能的许多方面仍然知之甚少。细菌可以通过与宿主或环境的相互作用获得遗传物质，表现出新的功能，包括由水平基因转移（HGT）事件产生的功能。HGT的一个典型例子是细菌获得抗生素抗性。在多发性硬化症（MS）（一种受环境因素影响并与AD共享一些神经退行性通路的自身免疫性脱髓鞘疾病）中，据报道HGT塑造了某些细菌的致病性。很可能是上述某些细菌遗传信息因HGT事件而发生了改变。
使用鸟枪法宏基因组学无法进行HGT分析，但长读长宏基因组学能够精确分析细菌染色体，使其成为研究HGT的有价值工具。长读长宏基因组学可以同时检测和可视化多个细菌物种染色体中的HGT事件，有助于对细菌（包括质粒和噬菌体相互作用）进行详细的功能分析。
我们假设本研究中报道的与AD痴呆潜在相关的细菌物种可能具有产生Aβ的特性。为了探索这一假设，我们计划使用长读长宏基因组学全面分析每种肠道细菌的功能基因，这将有助于更详细地了解它们在AD发病机制中潜在作用的遗传机制。
我们还研究了在健康成人中相对更丰富的肠道细菌的功能。C. butyricum和A. rectalis是产生丁酸盐的细菌，有助于肠道屏障完整性和抗炎作用。B. wexlerae产生代谢产物，如鸟氨酸、乙酰胆碱和S-腺苷甲硫氨酸，这些代谢物抑制脂肪积累，并与其他肠道细菌协同作用以改善肠道环境，可能预防或减轻肥胖和糖尿病。
尽管各种细菌物种已显示出抗炎、抗肥胖和糖酵解作用，但只有B. breve和A. butyriciproducens被报道可预防痴呆。我们假设上述细菌物种也可能表现出抗痴呆或Aβ分解作用。为了研究这一假设，我们计划使用长读长序列宏基因组学进行全面的肠道微生物群基因分析。
分析肠道细菌的功能作用必须考虑其代谢产物的影响。虽然基因组分析提供了对细菌遗传能力的见解，但代谢组分析对于理解细菌功能同样至关重要。
影响肠道微生物群组成的因素包括性别、饮食习惯和药物。其中，饮食习惯和口服药物尤为重要。结合混杂因素元数据的多变量分析显示，胃肠道药物、抗糖尿病药物、抗生素、抗血栓药、心血管和脑部疾病治疗药物以及抗癌药物依次对肠道微生物群影响最显著。具体而言，质子泵抑制剂、钾通道酸阻滞剂、渗透性泻药、氨基酸和胆汁酸抑制剂在胃肠道药物中影响显著，而α-葡萄糖苷酶抑制剂在抗糖尿病药物中影响显著。
Nagata等人也报告称，多药联合给药会增加机会致病菌的数量，并减少产生丁酸和乙酸等短链脂肪酸（SCFA）的物种。在我们的研究中，尽管一些参与者正在服用抗高血压药物，但没有人服用已知会强烈影响肠道菌群或同时服用多种药物的药物。此外，没有参与者表现出饮食偏差。
这项探索性研究首次提供了日本受试者肠道微生物群组成的初步见解。需要进一步的纵向研究以更好地了解这种组成如何随时间变化。我们识别了在AD组中倾向于相对更丰富的细菌物种，以及其他在健康成人中相对更丰富的物种。如果我们的初步发现能够得到更大规模研究的证实，这将表明在AD患者和健康对照之间存在一个中间群体。这个中间群体，被称为“AD储备组”，可能代表痴呆发病风险增高的个体。然而，这一假设需要在未来的大规模临床试验中得到验证。基于这些发现，需要进一步研究预防策略，如饮食干预和使用益生菌，最终推动AD预防项目的实施。目前，我们正在考虑使用本研究中确定的细菌物种开展AD预防项目。
此外，下一步将考虑使用人工智能来分析与AD发病相关（P）和与AD抑制相关（S）的细菌物种的比例。如果得到验证，从健康到临床前AD再到MCI/AD的阶段中P/S比值增加的假说，将能够对临床前AD组进行严格诊断。这种方法有潜力成为一种突破性的临床前AD筛查诊断工具。而且，通过痴呆保护性食物改善肠道菌群组成，或将AD抑制细菌移植到临床前AD组个体中，可以作为预防AD的策略。在此背景下，需要进行更大规模的研究，包括具有年龄和性别代表性的人群，以验证临床前AD状态。
此外，在摄入抗痴呆食物和食物成分前后，检查与AD和非AD状态相关的细菌动态变化，有助于严格评估其认知效果。此类研究也有助于开发新型抗痴呆食品和成分，进一步为AD预防策略做出贡献。
本研究存在一些局限性。首先，这是一项单中心研究，仅涉及31名参与者，研究的统计功效和普适性有限。需要进行更大规模、多中心的研究，基于正式的效力分析前瞻性确定样本量，以验证研究结果。考虑到样本量，本研究是假设生成性的，而非验证性的。其次，健康成人群体的平均年龄（35.3岁）远低于AD群体，这一点尤其重要，因为肠道微生物组组成会随着年龄增长而逐渐变化。为了解决这一局限性，我们纳入了三个不同年龄段的健康成人组，并分析了微生物群组成中潜在的年龄相关差异。然而，小样本量很可能阻碍了检测统计学显著差异，使得我们的研究是假设生成性的而非验证性的，因此强调需要进行更大规模的研究。第三，虽然我们的发现提示了特定细菌物种与AD之间的潜在关联，但并未建立因果关系。需要未来的纵向或干预性研究来评估时间变化和因果关系；采用更深入的测序方法（如鸟枪法宏基因组学、宏转录组学）以获得更高的分类学分辨率和功能见解；整合多组学（代谢组学）以将分类单元与代谢物和宿主反应联系起来。
5. 结论
对健康个体和AD患者粪便细菌的分析，识别了日本队列中可能与AD状态和非AD状态存在差异关联的人类肠道微生物群中的细菌物种。这些发现与其他种族中观察到的模式一致，为肠道微生物群作为AD预防中可调节因素提供了有前景的见解，并可能为该人群提供一种无创的风险分层和预防途径。然而，由于研究的探索性、小样本量、年龄不匹配的组别以及无法解决个体间差异，这些发现是假设生成性的而非验证性的。这强调需要进行大规模临床试验，并使用先进的宏基因组学技术对这些细菌物种进行详细的功能分析，以验证这些观察结果。
此外，考虑到通过补充剂重建肠道微生物群的潜力，需要进行长期的干预性研究，以评估改变肠道微生物组是否会影响患AD的风险，特别是在高危人群中。此类研究将对AD新型预防策略和干预措施的开发做出重大贡献。
