ATP合酶活性增强膜质子接受与侧向扩散，揭示局部质子偶联机制

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：ATP synthase activity boosts membrane proton acceptance and lateral diffusion

本文通过构建包含膜锚定光敏酸和活性FOF1ATP合酶的体外囊泡模型，首次直接观测到：在ATP合酶催化产生活性时，膜界面质子转移（PT）速率超快提升，质子扩散（PD）维度降至二维。该研究为解释“表观质子驱动力（pmf）不足时ATP仍可合成”的生物能量学悖论提供了直接证据，有力支持了质子泵与ATP合酶之间存在局部质子偶联（localized proton coupling）的新模型，挑战了经典化学渗透理论中质子“去局部化”扩散的假说。

　　

引言：生物能量转换与质子转移的谜题

生物能量转换的标志是在生物能量膜两侧建立非平衡的电化学梯度，其中质子扮演主要角色。根据Mitchell的经典化学渗透理论，储存的电化学势能——质子驱动力（proton motive force, pmf），由跨膜的质子浓度差和电位差组成。该理论最初假设pmf在耦合膜两侧的体相之间是恒定的，并由膜结合的质子泵产生和维持，而后被例如F_OF₁ATP合酶用于合成ATP。然而，一系列证据对pmf在两侧体相间恒定的观点提出了挑战。尽管长期以来认为pmf在膜上时空恒定，但越来越多的证据表明pmf具有丰富的时空动力学行为。此外，多项研究假设，从初级质子泵释放的质子首先沿膜横向转移，并不会快速与体相溶液的质子平衡。Heberle等人的开创性工作证明，光驱动泵细菌视紫红质在光照下释放的质子，沿膜表面转移的速度显著快于从表面到体相水的速度。随后的实验、计算和理论研究支持了这一观点。研究表明，质子能沿脂质膜快速移动，其横向扩散率几乎与体相水相当。膜表面基团被认为参与了侧向质子扩散（proton diffusion, PD），这将在动力学上与通过体相水的转移形成竞争。跨水体相-膜界面的能量势垒会影响界面处的质子活性。体相水与膜之间的平衡时间在秒量级。如果质子释放位点（生产者/源）与消耗位点（消费者/汇）之间的平均距离低于某个特定值L₀（定义了表面质子与体相质子之间的耦合距离），则平衡时间过短，质子无法与体相平衡。

质子生产者与消费者之间的侧向质子转移（proton transfer, PT）对ATP合酶的正常功能似乎至关重要。Toth等人测定了呼吸细胞线粒体内的pH梯度，发现质子梯度很小。测得的pH值几乎无法在含有酵母F_OF₁ATP合酶的重构系统中进行ATP合成。然而，当ATP合酶与活性质子转运细胞色素氧化酶共重构时，在测得的生理pH值下很容易发生ATP合成。这些结果表明了质子泵与ATP合成之间的动力学耦合。同样，嗜碱细菌的ATP合酶如何克服外部pH > 10时实现稳健的H⁺偶联ATP合成的生物能量学挑战，这一难题或许可以得到解决。在此pH值下，pmf太低，无法解释观察到的ATP合成。然而，在侧向动力学耦合的情况下，可以实现质子释放位点（质子泵）与消耗位点（ATP合酶）之间的高效连接，从而实现跨酶的、不依赖于pH的、快于扩散极限的质子转运。尽管有这些间接证据，但侧向动力学耦合的直接观察仍然缺失。

构建模型系统：膜锚定光敏酸与ATP合酶共重构

为了以极高的时间分辨率分析pmf的生产者与消费者是否侧向且动力学耦合，我们利用了一种激发态分子光敏酸探针（称为C₁₂-HPTS），其被锚定在脂质双分子层上，可在激发后在膜附近瞬时释放一个质子。在这些实验中，探针被激发并发生激发态质子转移（excited-state proton transfer, ESPT），而膜表面充当质子受体。利用超快时间分辨测量，膜嵌入探针的时间依赖性发射提供了关于质子解离、质子复合（与去质子化探针）以及PD的信息。ESPT过程后，存在两个竞争过程：质子逃逸和复合。这两个过程都取决于探针周围PD的维度。因此，追踪时间依赖性发射可以确定PT速率和PD的维度，后者指示了PT与膜的耦合。

我们将C₁₂-HPTS光敏酸嵌入由1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）组成的单层囊泡膜中，在有无活性嗜热芽孢杆菌菌株TF_OF₁ATP合酶的情况下，比较了PT速率和PD维度。通过建立跨膜的pH梯度（而非光触发光敏酸）来创建pmf，从而激活TF_OF₁ATP合酶。光敏酸C₁₂-HPTS作为报告分子，用于追踪膜界面发生的PT和PD过程以及质子可能逃逸到体相的情况。在存在作为质子消费者的产ATP的TF_OF₁ATP合酶时，观察到了出乎意料的快速PT速率，且PD维度降低至2。与膜嵌入的C₁₂-HPTS（在激发时于膜表面附近释放其质子）相反，当TF_OF₁ATP合酶具有活性时，囊泡腔内的可溶性HPTS并未像C₁₂-HPTS观察到的那样快速地转移其质子。

OF₁ATP合酶的LUV部分，(II) 描绘了含有嵌入TF_OF₁ATP合酶的部分。(A) POPC (p)LUV，(B) 掺有膜锚定光敏酸C₁₂-HPTS的POPC (p)LUV，以及(C) 填充有水溶性HPTS的POPC (p)LUV。下方显示了C₁₂-HPTS和HPTS的化学结构。">

验证共重构系统与ATP合酶活性

为了探索酶如何影响来自C₁₂-HPTS的PT及随后的PD，我们将嗜热芽孢杆菌PS3 TF_OF₁ATP合酶和膜锚定光敏酸C₁₂-HPTS共重构到POPC大型单层囊泡中。为确保C₁₂-HPTS不影响ATP合酶的重构效率R_eff，我们比较了不含与含有C₁₂-HPTS的POPC LUVs的R_eff。选择标称蛋白-脂质比为1:20,000，POPC LUVs掺入1 mol% C₁₂-HPTS。密度梯度离心分析表明，在纯POPC囊泡中ATP合酶的重构效率为R_eff= 75 ± 12%，而在存在膜锚定光敏酸C₁₂-HPTS的情况下，获得了几乎相同的值R_eff= 73 ± 11%。这些结果表明，两亲性C₁₂-HPTS重构到POPC囊泡中不会影响蛋白质的重构效率。

由于囊泡大小可能影响囊泡腔的酸化过程，我们接下来使用动态光散射测定了LUV直径。在误差范围内，结构A.II和B.II的LUV直径相同。不含重构蛋白质的LUVs直径约为130 nm，与文献值一致。含蛋白质LUVs（pLUVs）直径略大的趋势归因于大的TF_OF₁ATP合酶，其F₁亚基延伸出膜平面约10 nm。我们使用pLUV直径和蛋白-脂质比估算了每个囊泡的蛋白质数量N_protein，假设POPC脂质面积为0.63 nm²，ATP合酶面积为20 nm²。结构A.II和B.II的值几乎相同，分别为N_protein= 10 ± 5 和 8 ± 4。

N_protein不报告蛋白质的取向。因此，我们接下来分析了重构ATP合酶的取向。我们测定了POPC和POPC/C₁₂-HPTS LUVs中重构ATP合酶的取向χ。χ = 83 ± 2% （A.II）和 χ = 85 ± 5% （B.II）的值表明，超过80%的TF_OF₁ATP合酶分子以F_O亚基指向囊泡外侧的方式取向。由于pmf是在囊泡系统中建立的，囊泡腔内pH更酸，因此只有那些F₁亚基指向囊泡外侧的酶会被pmf激活。总体而言，我们的结果表明，将C₁₂-HPTS共重构到pLUVs中不会改变囊泡结构、蛋白质数量和取向，这是定量分析PT动力学和PD维度的先决条件。

接下来，我们验证了TF_OF₁ATP合酶在有无C₁₂-HPTS但未光照光敏酸（即C₁₂-HPTS不作为质子源）的情况下是否同样具有活性，并定义了酶使用pmf产生ATP的时间窗口。我们通过施加跨膜pH梯度ΔpH = 4.1来激活蛋白质，并使用标准化学发光法监测随时间变化的ATP产生，以获取n_ATP(t)。在t = 0秒建立梯度激活了酶，标志着ATP合成的开始。观察到ATP量增加约30秒（时间窗口t₃），直到发光信号饱和，表明ATP浓度恒定（t₄）。时间轨迹报告表明，在给定条件下，ATP合酶活跃约30秒。我们通过计算转换数（turnover number, TON）来量化酶的活性。从N ≥ 5个独立实验中，我们得到TON = 8.4 ± 3.1 s^-1（A.II）和TON = 8.3 ± 3.1 s^-1（B.II），表明TF_OF₁ATP合酶的活性不受膜中C₁₂-HPTS存在的影响。

C₁₂-HPTS在活性ATP合酶存在下的稳态与时间分辨荧光测量

在验证ATP合酶活性后，我们使用结构B.II来确定C₁₂-HPTS的PT和PD参数随ATP合酶活性的变化。C₁₂-HPTS是一种布朗斯特光敏酸，由于其基态和激发态之间的pK_a值差异很大，仅在激发态时才变为酸性。确定C₁₂-HPTS在POPC LUVs和pLUVs中的pK_a值，基态为7.5，激发态为0.7。需要强调的是，从1 mol%膜锚定光敏酸释放的质子不是pmf的来源，也不会激活TF_OF₁ATP合酶。C₁₂-HPTS作为光谱探针，用于追踪光敏酸在膜表面的快速（纳秒级）PT事件以及对探针周围PD敏感的质子复合过程。我们利用此光敏酸探索发生在毫秒到秒时间尺度的ATP合酶活性如何影响膜界面的PT过程。

由于质子化光敏酸（ROH）和去质子化光敏酸（RO^-*）的发射波长不同，稳态光谱中两个荧光发射峰值的比值反映了它们的平衡浓度比。由于C₁₂-HPTS必须在质子化（ROH）状态下被激发才能用作PT探针，且其在POPC膜中的基态pK_a为7.5，我们使用pH 4.7的酸性缓冲液。非酸性缓冲液调节至pH = 7.4，产生ΔpH = 2.7。我们首先在pH 7.4对称条件（时间窗口t₁）和pH 4.7对称条件（t₂）下记录了C₁₂-HPTS在POPC LUVs（B.I）和pLUVs（B.II）中的稳态荧光发射光谱。在这两种条件下，均未建立pmf，因此ATP合酶无活性。稳态荧光光谱在含有C₁₂-HPTS的LUVs与存在ATP合酶的pLUVs之间几乎相同。正如预期，由两个发射峰比值给出的[RO^-*]/[ROH^*]比率在低pH值（t₂）时更小。较大的质子浓度（低pH）既减缓了ESPT速率，更显著地增加了质子复合速率。这些结果验证了在ATP合酶无活性的条件下，跨膜酶的存在不会改变PT过程。

然后，我们研究了酶激活后的PT和PD特性。通过创建pmf激活ATP合酶后，我们观察到在pLUVs中探针的稳态荧光与缺乏酶的LUVs相比发生了 dramatic 变化。建立pmf后，ROH^*谱带几乎完全消失，导致[RO^-*]/[ROH^*] = 18.6 ± 2.6。从ATP产生的时间依赖性测量中，我们知道ATP合酶活跃约30秒，之后失去活性。因此，在pH切换2分钟后测量的第二个稳态荧光光谱导致pLUVs中[RO^-*]/[ROH^*] = 4.1 ± 0.4，酶无活性（t₄）。这使ROH^*谱带增加到与不含酶的LUVs相似的水平（[RO^-*]/[ROH^*] = 4.3 ± 0.4）。在活性ATP合酶存在下ROH^*谱带的这种消失（大的[RO^-*]/[ROH^*]）是前所未有的，无论膜的性质、pH或温度如何。这可能源于从探针到膜表面的超快ESPT过程、复合过程的急剧减少以及PD维度的一些影响。

12-HPTS的光谱测量。(A) t₁阶段（参见图2）pLUVs（浅蓝）和t₂阶段pLUVs（蓝）的稳态荧光。不含蛋白质的LUVs（灰和黑）在t₁和t₂阶段作为对照显示。(B) t₁阶段LUVs（灰）和pLUVs（浅蓝）以及t₂阶段LUVs（黑）和pLUVs（蓝）的时间分辨荧光。前3 ns的衰减曲线在单独放大图中显示。(C) 存在活性蛋白质（t₃）时LUVs（黑）和pLUVs（红）以及存在无活性蛋白质（t₄）时pLUVs（浅红）的稳态荧光。(D) 存在活性蛋白质（t₃）时LUVs（黑）和pLUVs（红）以及存在无活性蛋白质（t₄）时pLUVs（浅红）的时间分辨荧光。前3 ns的衰减曲线在单独放大图中显示。">

超快时间分辨荧光测量允许区分ROH激发后不同时间尺度上的不同过程。初始步骤是从锚定探针到膜表面的ESPT，观察到为ROH^*的初始衰减。该步骤取决于膜表面接受质子的能力，发生在几皮秒到几百皮秒的时间尺度上。从实验角度看，k_PT可以直接从这些早期时间尺度提取。ESPT过程后，发生两个竞争过程：质子复合和质子逃逸。质子复合可以在 >0.5 ns 的时间尺度上追踪。质子逃逸是指质子从探针（RO^-*）附近“消失”，进入体相或不同的质子汇。重要的是，这两个过程都取决于探针周围PD的维度和其他扩散相关参数。与稳态测量一致，建立pmf前的时间分辨荧光曲线在有无酶存在时是相同的。同样与稳态测量一致，只有在ATP合酶产生ATP时（t₃），与对照相比，观察到探针荧光衰变的 dramatic 变化。这种变化在早期衰减部分和长寿命荧光尾部都很明显。在pH切换2分钟后（t₄）测量C₁₂-HPTS的荧光衰变，得到与不含酶的对照样品几乎相同的曲线。在ATP合酶的ATP生产阶段，C₁₂-HPTS探针的初始荧光衰变极快，比以往任何重构膜观察到的都要快得多。拟合此初始衰减得到k_PT= 15.9 ± 2.3 ns^-1。作为比较，C₁₂-HPTS在POPC LUVs中的k_PT值为2.5 ± 0.3 ns^-1，而ATP合酶无活性时（t₄）C₁₂-HPTS在pLUVs中的值为2.7 ± 0.4 ns^-1。含有活性ATP合酶的pLUVs中C₁₂-HPTS的极大k_PT值出乎意料，因为它甚至大于体相水中HPTS的k_PT值（约9 ns^-1），而水通常是PT速率的上限，因为水是极好的质子受体。这一发现凸显了活性ATP合酶作为来自膜的质子的极其高效的质子受体的基本作用。

ROH^{*在较长时间尺度上的荧光衰减可以确定相关质子的PD相关特性。正如Agmon等人早期工作以及Stuchebrukhov等人最近的工作所证明的那样，ROH*的长寿命荧光尾部可用于提取相关质子的PD维度。这些模型基于ESPT过程后围绕激发光敏酸的“相关质子云”的动力学扩散模型，同时考虑释放质子与去质子化光敏酸之间的相关复合过程。根据模型，在时间分辨荧光实验中测量的ROH*荧光尾部（校正了光敏酸的辐射寿命后）表现出幂律衰减，这指示了PD过程的维度d。通过拟合所述模型到p_ROH*曲线，我们可以从长时间渐近线的斜率提取维度。我们发现对照POPC LUVs表面的维度为d = 2.7 ± 0.2。这种分形维度表明，在质子在膜表面从C₁₂-HPTS瞬态释放后，部分质子横向（2D）扩散，而其他质子向体相水（垂直于膜，3D）扩散。然而，当ATP合酶产生ATP时，来自探针的PD维度为d = 1.8 ± 0.3。该值表明，ATP合酶的活性导致从C₁₂-HPTS释放的质子在膜表面进行纯二维PD。ATP合酶的活性阻止了质子从膜表面逃逸到体相。p_ROH*的大小由B因子和τ₀决定。当使用B因子约5时，拟合得到POPC LUVs的τ₀值为300 ± 100 ps，而含有活性ATP合酶的pLUVs为18 ± 10 ps。由于τ₀与扩散系数D成反比，我们可以得出结论，不仅ATP合酶激活时PD维度发生 dramatic 变化，而且膜表面的PD系数也发生了一个数量级以上的增加。由于膜表面的介电常数未知，我们将避免给出D的确切值。}

了解k_PT值和稳态[RO^-*]/[ROH^*]进一步允许计算质子复合速率k_rec，同时考虑RO^-*的失活衰变速率k_rx，该速率对所有样品相同（0.2 ns^-1）。计算得出的质子复合率为：具有活性ATP合酶的pLUVs为k_rec= 0.7 ns^-1，对照POPC LUVs为0.4 ns^-1（与具有无活性酶的pLUVs数量级相同）。活性酶膜与无酶膜（或无活性酶膜）之间相对相似的质子复合率意味着，稳态测量中观察到的大差异主要由从探针到膜表面的PT决定。正如我们之前在囊泡内C₁₂-HPTS探针的pH依赖性PT动力学研究中所表明的，复合过程对溶液pH不太敏感，因此表明来自膜表面的相关质子是与RO^-*复合的主要质子。

抑制TF_OF₁ATP合酶活性以验证关联性

为了进一步证实观察到的C₁₂-HPTS的ESPT变化与TF_OF₁ATP合酶活性相关，我们在抑制酶后监测了ESPT参数。我们选择了市售抑制剂寡霉素，它与ATP合酶的F_O亚基相互作用。与其它市售抑制剂如N,N′-二环己基碳二亚胺不同，寡霉素不