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这项研究在神经低温保存领域取得了里程碑式进展，揭示了成年小鼠大脑海马切片及原位全脑经过玻璃化冷冻保存后，其结构完整性、线粒体代谢、神经元兴奋性、突触传递与可塑性（包括长时程增强LTP）等关键生理功能在短期内可成功恢复。该成果不仅将已知的脑组织生物物理耐受极限从低温休眠扩展至深低温冻结状态，也为实现功能性神经组织的长期、高质量保存提供了可行方案，对神经科学研究可重复性、动物福利、组织库建设乃至未来生命暂停技术（life-suspending technologies）的发展具有深远意义。
成年哺乳动物大脑的低温保存一直是个巨大挑战，传统冷冻方法因冰晶形成会严重破坏神经结构。玻璃化作为一种能避免结晶的冷冻方法，为这一难题提供了新思路。本研究首次系统考察了玻璃化冷冻在成年小鼠海马体中的应用，并取得了突破性进展。
结果
海马切片的玻璃化方案。研究优化了一套玻璃化方案，旨在平衡多种潜在的损伤因素，包括冷冻保护剂的毒性、渗透性收缩与肿胀、冰晶形成、物理开裂以及低温损伤。优化的程序包括在特定温度下，利用一种名为V3的冷冻保护液（由二甲基亚砜、乙二醇、甲酰胺和聚乙烯吡咯烷酮K12混合而成）对脑切片进行逐步加载和卸载。切片被定向冷却并储存在-150°C以下，然后在特定条件下快速复温。成功实现玻璃化的切片呈现光泽透明状，而失败则表现为浑浊不透明。通过立体显微镜观察，可以直观地预测冷冻保存的成功与否。
代谢恢复。通过测量海马CA1区的耗氧率评估线粒体功能。研究发现，经优化方案处理后，即使使用标准浓度的冷冻保护剂（59% w/v V3）进行玻璃化，与单纯加载同等浓度保护剂而未冷冻的对照组相比，其基础呼吸和备用呼吸容量均未显示出显著差异，表明玻璃化过程本身对细胞代谢的额外影响有限。然而，高浓度（65% w/v V3）的保护剂暴露会显著降低基础呼吸速率。
形态学评估。电镜分析显示，玻璃化后海马体的超微结构保存完好，包括神经元、突触和线粒体。仅在卸载完成后立即固定的样本中观察到少量线粒体肿胀，但该现象在人工脑脊液中孵育后消失。尼氏染色和共聚焦成像进一步证实，玻璃化后海马体的细胞构筑和神经元树突形态得到了良好保持，树突棘的密度和长度与对照切片无显著差异。
脑切片玻璃化后的电生理恢复。研究重点考察了海马神经环路的功能恢复。在谢弗侧支-CA1锥体细胞突触的场电位记录中，玻璃化后的切片虽然输入-输出曲线在高刺激强度下略有下降，但基本的突触传递功能得以保留。短时程可塑性在玻璃化后有所减弱，而通过钾通道阻滞剂4-AP诱导的最大递质释放能力则未受影响。尤为重要的是，作为学习记忆关键细胞基础的长时程增强（LTP）在玻璃化后的CA1突触上被成功诱导，其增强幅度与对照组相比无统计学差异。在齿状回的穿通通路-颗粒细胞突触上，玻璃化后甚至观察到了增强的LTP。
在全细胞膜片钳记录中，玻璃化后的CA1锥体细胞静息膜电位、输入电阻和膜电容与对照组一致，自发突触活动的频率也未改变。然而，其兴奋性有所降低，表现为动作电位阈值升高，且在较小去极化电流下的放电次数减少。相比之下，齿状回颗粒细胞在玻璃化后保持了正常的放电特性，其自发突触活动频率亦与对照相同。对CA1区中间神经元的记录表明，抑制性网络在玻璃化后依然具有功能。兴奋性与抑制性突触驱动的平衡在齿状回颗粒细胞上未发生明显改变，表明玻璃化不太可能导致病理性神经环路失衡。
原位全脑玻璃化。在成功保存脑切片的基础上，研究尝试将玻璃化技术扩展至原位全脑。这面临更大挑战，主要源于血脑屏障对冷冻保护剂和水通透性的不匹配，易导致脑组织过度脱水。通过采用交替灌注的“交错平衡”策略，研究者实现了大脑体积的部分保留，避免了致死性脱水。复温后，通过高胶体渗透压溶液进行低流速灌注，以洗脱冷冻保护剂。
从经过原位玻璃化保存的全脑中制备的海马切片显示，其基础呼吸和备用呼吸容量与切片玻璃化组无显著差异。电生理记录表明，齿状回颗粒细胞的静息膜电位轻微去极化，膜电容减小，但其放电阈值正常，且在较大去极化电流下放电增强，提示其内在兴奋性可能有所升高。自发突触后电位正常发生，兴奋/抑制平衡保持不变。穿通通路-颗粒细胞突触的基本传递功能保存良好，其LTP也能被成功诱导，尽管短时程可塑性显著降低。
讨论
研究表明，大脑的耐受极限不仅限于低温休眠，更可延伸至深低温的玻璃化状态。成年小鼠海马体在经历分子运动完全停止的玻璃化状态后，能够在短期内恢复近生理水平的功能，包括形态、代谢和复杂的电生理活动。这强有力地支持了“大脑功能是其结构涌现特性”的观点。不同类型的神经元对玻璃化过程的反应存在差异，这可能与其大小、膜特性或代谢活性有关。冷冻保护剂的峰值浓度会引起剂量依赖性的线粒体应激反应。通过血管灌注对全脑进行玻璃化面临独特挑战，主要源于血脑屏障的通透特性，未来针对水通道蛋白的调控可能是一个优化方向。此外，脑组织能耐受急性脱水至原质量的70%，但低于45%的严重脱水则无法恢复，这提示在追求脱水以减少冰晶损伤时需谨慎平衡。当前的全脑方案成功率尚需提高，但已证实的功能恢复为后续优化提供了基础与希望。这项工作为神经科学实验材料的跨时空分发、提高可重复性、改善动物福利，以及最终为神经组织的长期功能性保存开辟了道路，也让生命暂停技术这一设想向现实更近了一步。
