孤儿核受体NR4A1在介导酒精戒断相关焦虑样行为中的作用

酒精戒断诱导的焦虑样行为与NR4A1/BCL2相互作用介导的PFC神经元凋亡相关，条件性敲除NR4A1可减少凋亡并缓解焦虑。

　　

张彦杰|吴飞|徐志刚|李向学|赵康青|倪赵军|程指导|张忠|王丹|王传生|王慧英|高学蛟|张瑞玲|孙洪强

北京大学第六医院，北京大学心理健康研究所，国家卫生健康委员会心理健康重点实验室（北京大学），国家精神疾病临床研究中心（北京大学第六医院）

摘要

背景

酒精戒断引起的焦虑是治疗酒精依赖（AD）的关键靶点。研究表明，焦虑与前额叶皮层神经元凋亡有关。研究还指出，核受体亚家族4组A成员1（NR4A1）与焦虑和凋亡都有关。然而，目前尚不清楚NR4A1是否通过调节前额叶皮层（PFC）神经元的凋亡来参与酒精戒断引起的类似焦虑的行为。

方法

我们使用CPP范式建立了酒精偏好小鼠模型，随后进行16小时的酒精（20%乙醇；2 g/kg/天，腹腔注射）戒断。我们还利用Cre-LoxP系统生成了NR4A1条件性敲除小鼠。通过开放场测试、明暗箱测试和升高迷宫测试检测了三组小鼠的类似焦虑的行为：对照组、乙醇组以及NR4A1敲除加酒精处理组。Western blotting、实时PCR和免疫荧光技术用于评估三组中NR4A1、B细胞淋巴瘤2（BCL2）、BCL2相关X蛋白（BAX）和caspase3的表达。免疫荧光和共免疫沉淀技术分别用于研究NR4A1和BCL2的共定位和结合情况。

结果

我们的研究发现，酒精促进了促凋亡相关基因（如BAX和caspase3）的表达。我们还发现，酒精不仅促进了NR4A1和BCL2的表达，还增强了它们之间的相互作用。这种相互作用导致BCL2的功能从抗凋亡因子转变为促凋亡因子。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的上调导致神经元凋亡，并在酒精戒断期间引发类似焦虑的行为。NR4A1条件性敲除显著减少了前额叶神经元的凋亡，并缓解了酒精戒断引起的类似焦虑的行为。

结论

这些结果表明，NR4A1通过逆转BCL2的抗凋亡功能并促进BAX和caspase3的表达，参与了酒精戒断引起的类似焦虑的行为。

引言

酒精依赖（AD）是一种由过度饮酒引起的疾病，其特征是强迫性饮酒和持续或规律的饮酒行为。主要症状包括生理依赖、酒精耐受性增加、戒断反应以及表现为对酒精的强烈渴望的心理依赖。全球范围内，3.7%的成年人患有AD [1]。焦虑是与戒断相关的最明显的症状，也是导致AD复发的关键因素 [2]。酒精戒断引起的焦虑是治疗AD的关键靶点 [3]。

前额叶皮层（PFC）在焦虑中起着关键作用。它涉及灵长类动物用来调节对焦虑诱发情境反应的高级策略 [4]。PFC障碍与多种类型的病理焦虑有关，包括广泛性焦虑障碍、社交焦虑障碍和恐惧症 [5]。PFC功能障碍也被认为是酒精摄入和戒断期间焦虑发展的重要因素。先前的研究表明，小鼠暴露于酒精会引发类似焦虑的行为，这至少部分归因于小胶质细胞的激活以及PFC内小胶质细胞-神经元关联的增强 [4]。另一项研究报告称，雄性小鼠长期饮酒会导致前额叶皮层兴奋性突触的异常修剪和大量丧失，从而增加类似焦虑的行为 [6]。因此，PFC在调节酒精戒断期间的类似焦虑行为中起着关键作用。

NR4A1（核受体亚家族4组A成员1），也称为TR3（睾丸受体3）、NGFIB（神经生长因子诱导蛋白B）或NUR77（核受体77），属于核受体超家族成员。NR4A1在前额叶皮层区域高表达。研究表明，狼疮模型小鼠表现出类似的焦虑行为，同时NR4A1表达减少。值得注意的是，恢复NR4A1表达足以缓解这些行为异常 [7]。此外，先前的研究显示NR4A1可以被抗焦虑药物地西泮抑制 [8]。总体而言，这些结果表明NR4A1是调节类似焦虑行为的关键靶点。NR4A1也被认为是一种对慢性酒精敏感的候选基因 [9]。然而，NR4A1在酒精戒断引起的类似焦虑行为中的作用和机制尚未阐明。

神经元凋亡可导致焦虑，针对这一过程的干预措施有助于缓解焦虑。小鼠研究表明，凋亡参与了脑损伤引起的焦虑 [10]。对焦虑干预措施的研究表明，丝胶蛋白可以通过减少PFC和海马区的神经元凋亡来帮助缓解焦虑 [11]。同样，某些植物提取物也被发现可以通过抑制神经元凋亡来缓解焦虑 [12]。研究还表明NR4A1在凋亡中起着关键作用。NR4A1诱导凋亡的分子机制已被广泛研究。研究表明，NR4A1在线粒体内与BCL-2结合，使其从抗凋亡形式转变为促凋亡形式，从而触发程序性细胞死亡 [13]、[14]、[15]。尽管神经元凋亡导致焦虑的分子机制以及NR4A1通过逆转BCL2功能诱导凋亡的机制相对明确，但尚不清楚酒精戒断引起的类似焦虑行为是否与NR4A1介导的BCL2功能逆转和随后的神经元凋亡有关，尤其是在前额叶皮层中。

在本研究中，我们发现酒精增加了小鼠前额叶皮层中NR4A1和BCL2的表达，并增强了它们之间的结合，同时上调了促凋亡蛋白BAX和caspase-3的表达。这导致了神经元凋亡以及酒精戒断期间CPP和类似焦虑行为的发展。我们使用loxP-Cre系统在前额叶皮层条件性敲除了NR4A1，结果减少了前额叶神经元的凋亡并缓解了类似焦虑的行为。然而，NR4A1的条件性敲除并未影响酒精诱导的CPP。我们的发现表明，NR4A1通过逆转BCL2的抗凋亡功能并上调促凋亡蛋白的表达，在酒精戒断期间的类似焦虑行为中发挥作用。

章节片段

动物

NR4A1^flox/flox小鼠是通过将NR4A1^flox/+小鼠（购自Cyagen Biosciences Inc.公司，中国苏州）与CamK2a-Cre小鼠（Cyagen Biosciences Inc.，中国苏州）杂交获得的，得到了基因型为NR4A1^flox/+-Camk2a-Cre的代际。然后，将NR4A1^flox/flox小鼠与NR4A1^flox/flox和NR4A1^flox/+-Camk2a-Cre小鼠进行杂交，通过筛选和基因分型，得到了NR4A1^flox/flox-Camk2a

酒精戒断会导致类似焦虑的行为，而在前脑条件性敲除NR4A1可以部分缓解这种行为

各组小鼠之间的CPP基础值没有显著变化（F (2, 25) = 3.132, P = 0.061, R² = 0.2000；图2A），但在EtOH组和KO-EtOH组中呈下降趋势。单因素方差分析显示Con组、EtOH组和KO-EtOH组之间的CPP评分存在统计学显著差异（F _{(2, 25)} = 7.922, P = 0.002, R² = 0.388；图2B）。Tukey的事后检验显示EtOH组的CPP评分显著增加（P < 0.05）

讨论

长期和过量饮酒可导致酒精使用障碍（AUD）。AUD的严重形式是AD，患者可能会出现戒断症状，其中焦虑是一个显著症状 [20]。对小鼠和大鼠的研究表明，长期酒精暴露会增加戒断期间的类似焦虑行为 [2]、[4]。在本研究中，我们发现酒精戒断增加了小鼠前额叶皮层中NR4A1和BCL2的表达，并增强了它们之间的结合

结论

在我们的研究中，酒精戒断导致小鼠前额叶皮层中NR4A1的表达增加，最终通过与BCL2结合并逆转其抗凋亡功能，导致类似焦虑的行为。

CRediT作者贡献声明

程指导：研究，数据管理。张忠：研究，数据管理。王丹：研究，数据管理。王传生：研究，数据管理。王慧英：研究，资金获取，数据管理。高学蛟：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，监督，研究，数据管理。张彦杰：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，研究，资金获取，数据管理。张瑞玲：撰写——

利益声明

作者声明没有利益冲突。

资助

本研究得到了河南省自然科学基金（编号：242300421539）、河南省科技研发计划联合基金（工业）重大项目（编号：235101610004）、河南省省市部门共同建设的科技研发重大项目（编号：222102310710）、河南省科技研发项目（编号：242102310286）以及河南省重点研究项目的支持

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。