《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：Mitochondrial complex-derived ROS induces lysosomal dysfunction and impairs autophagic flux in human cells carrying the APOE4 allele
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APOE4携带者成纤维细胞显示线粒体生物能降低、氧化应激增强及溶酶体降解功能受损，而sAD细胞以复杂I氧化损伤为主。通过靶向抑制线粒体复杂III产生的ROS，成功恢复APOE4细胞的自噬流和溶酶体功能，揭示APOE4特异性破坏线粒体-溶酶体轴的机制。
Sandra A. Ni?o|Oskar Barrios-Camus|Eduardo Silva-Pavez|J. César Cárdenas|Christian González-Billault
智利大学科学学院生物学系，细胞与神经元动力学实验室，圣地亚哥，智利
摘要
APOE4等位基因是散发性阿尔茨海默病（sAD）最强的遗传风险因素，但其对细胞的自主影响仍知之甚少。尽管年轻的、无症状的APOE4携带者表现出异常的大脑代谢，但线粒体功能障碍与溶酶体-自噬失败之间的机制联系仍不清楚。在这项研究中，我们对来自APOE3对照组、APOE4携带者和sAD患者的原代人类成纤维细胞进行了全面分析，以评估线粒体生物能量代谢、氧化应激、自噬和溶酶体功能。APOE4成纤维细胞显示出与线粒体含量相关的标志物（PGC1α、mtDNA）增加，同时伴有呼吸能力下降、质子泄漏增加以及线粒体ROS（活性氧）过度产生。此外，APOE4成纤维细胞的自噬通量受损，LC3-TOMM20的共定位减少，表明其线粒体自噬功能存在缺陷。使用DQ-BSA检测的溶酶体蛋白水解活性显著降低，并且在饥饿条件下也没有恢复，而sAD细胞则部分恢复了这种功能。通过特异性抑制剂靶向线粒体ROS发现，复合体III产生的ROS是APOE4成纤维细胞中氧化应激的主要驱动因素，而在sAD细胞中主要是复合体I起作用。值得注意的是，选择性抑制复合体III产生的ROS可以恢复APOE4细胞的溶酶体降解、自噬通量和线粒体呼吸功能。这些发现表明，线粒体氧化应激以APOE4特异性的方式破坏了线粒体-溶酶体轴，揭示了可能先于神经退行性病变的早期和机制上的差异。我们的结果挑战了APOE4仅放大AD病理学的观点，而是将特异性氧化还原信号传导确定为基于等位基因的干预措施的有希望的目标。
引言
散发性阿尔茨海默病（sAD）主要发生在晚年。在所有已知的遗传因素中，APOE4等位基因是非痴呆个体中与年龄相关认知衰退最强的风险因素[1]。然而，这种关联背后的生物学机制仍大部分未得到解决。APOE基因有三种主要等位基因（ε2、ε3、ε4），其中ε4与sAD的发展最为相关[2]、[3]。除了错误折叠蛋白质的积累外，sAD还表现为显著的线粒体功能障碍，这一点通过PET成像和生物能量代谢标志物的降低得到了证实[4]、[5]。这些改变不仅限于中枢神经系统[6]，也在外周组织（如血小板、成纤维细胞和肌肉）中被检测到[7]、[8]、[9]、[10]，这支持了线粒体功能障碍是sAD的系统性特征，而不是β-淀粉样蛋白或tau蛋白损伤的次要后果的观点。
有趣的是，对年轻APOE4携带者的功能性神经影像学研究显示，即使在没有其他蛋白质病变迹象的情况下，也存在神经元活动异常[11]。由于线粒体功能和葡萄糖代谢调节大脑的振荡动态，它们也影响神经元群体的功能连接性[12]。多项研究表明，APOE4等位基因可以直接影响线粒体状态，即使在未临床诊断为sAD的个体中也会导致早期代谢障碍[13]、[14]、[15]。最显著的发现包括线粒体质量增加、葡萄糖转运蛋白和单羧酸激酶（糖酵解途径）水平升高，以及参与酮体代谢的蛋白质（SCOT和AACS）和电子传递链（ETC）复合体I、II和IV中的酶水平升高（Mahley等人，2023年；[16]、[17]、[18]、[19]、[20]）。
此外，编码线粒体外膜转运蛋白TOMM40的基因组区域与APOE基因之间存在遗传相互作用，两者共享共同的增强子元件[21]。还有研究表明，APOE4容易被蛋白酶切割，产生脂质结合的C末端片段[22]、[23]，这些片段主要定位于受sAD影响的脑神经元中的线粒体[24]。在线粒体内，这些片段可能通过抑制复合体III（UQCRC2）的活性来干扰呼吸过程。它们还可能破坏复合体IV蛋白（如COX4I1）的组装或转运，最终导致细胞能量功能障碍[17]、[25]。然而，由于许多研究依赖于使用合成APOE4片段的体外实验或人源化小鼠模型，因此仍存在实验上的空白：这些方法不能准确反映人类大脑中蛋白质的生理水平或条件。此外，关于人类大脑样本中APOE片段表达的证据有限且相互矛盾：一些研究未发现等位基因之间的差异，而其他研究则观察到统计学上的显著变化。这些发现表明，线粒体是APOE4诱导的病理生理学中的早期且相关的细胞内靶点。
在这种情况下，人类成纤维细胞提供了一个有吸引力的模型，因为假设与遗传背景相关的普遍分子缺陷可以在任何细胞类型中检测到[26]（Ambrosi等人，2014年）。尽管成纤维细胞不属于中枢神经系统，但它们具有保守的代谢和质量控制途径，包括线粒体动力学、氧化还原平衡和溶酶体功能[6]。这些特性使它们成为探索与遗传风险变异（如APOE4）相关的细胞表型的合适平台，而无需额外的遗传操作。
最近，Payne等人[27]使用原代人类成纤维细胞和先进技术（包括功能性神经成像和线粒体功能评估）根据细胞损伤程度对新诊断的帕金森病患者进行了准确的分层。类似的方法已被证明有助于区分疾病的早期阶段，如轻度认知障碍和sAD[28]。尽管具有这种潜力，但在APOE4等位基因背景下整合多个线粒体损伤维度的比较研究仍然不足。这一空白阻碍了我们对遗传易感性与细胞质量控制途径如何相互作用以引发神经退行性过程的理解。为了解决这个问题，本研究在原代人类成纤维细胞中进行了全面的比较分析，评估了生物能量代谢、氧化应激、与线粒体含量相关的指标、自噬和溶酶体功能，以区分APOE4特异性效应和sAD相关机制。
部分摘录
人类成纤维细胞
人类成纤维细胞来自Coriell研究所（美国新奥尔良），并按照该机构提供的指南进行培养（
https://www.coriell.org ）。研究方案得到了智利大学科学学院伦理委员会的批准（FONDECYT编号3230131）。所有成纤维细胞培养物均来自死后皮肤活检，表现出相似的形态和生长特征。每位捐赠者的 demographic 和临床信息如下
APOE4和sAD成纤维细胞中的线粒体ROS和生物能量代谢特征
在第一组实验中，我们对成纤维细胞中的线粒体功能进行了全面评估，以确定等位基因特异性的生物能量变化。MitoSOX检测显示，与APOE3细胞相比，APOE4和sAD细胞中的超氧阴离子（O?•?）水平升高（图1A和B）。为了进一步检查线粒体功能状态，我们接下来评估了线粒体膜电位（ΔΨm；图1C）。定量分析显示，APOE4成纤维细胞的ΔΨm显著降低
讨论
在这项研究中，我们阐明了与APOE4等位基因相关的线粒体改变与散发性阿尔茨海默病中观察到的改变之间的本质差异。虽然这两种情况都表现出线粒体氧化应激增加和降解途径受损，但我们的数据表明，APOE4成纤维细胞表现出独特的线粒体重塑、线粒体自噬功能障碍和明显的溶酶体功能障碍组合。这项工作的一个关键发现是线粒体氧化还原状态
局限性和未来方向
本研究的局限性在于APOE3、APOE4和sAD成纤维细胞捐赠者的年龄并不严格匹配（分别为57岁、39岁和60岁）。捐赠者的选择是基于APOE基因型和临床分类，而不是实际年龄，因为我们的主要目的是将等位基因特异性的线粒体和溶酶体表型与散发性阿尔茨海默病中观察到的表型进行对比。值得注意的是，尽管APOE4成纤维细胞是最年轻的捐赠者，但它们表现出最明显的
CRediT作者贡献声明
Sandra A. Ni?o： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，概念化。Oskar Barrios-Camus： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究。Eduardo Silva-Pavez： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，研究，形式分析。J. César Cárdenas： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督。
资助
本研究得到了ANID/FONDECYT （编号15150012）（C.C, CG-B）的支持。ANID/FONDECYT博士后奖学金 （编号3230131，S.A.N）和（编号3220604，ES-P）。此外，本研究还获得了智利圣塞巴斯蒂安大学研究与博士项目办公室（fondo USS-FIN-23-FAPE-12）的资助。
未引用的参考文献
[58], [59], [60], [61], [62], [63], [64], [65]
利益冲突声明
作者声明本研究未涉及可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系。
致谢
我们感谢智利政府的
国家研究与发展局（ANID） 提供的财政支持。最后，本综述中的所有图表均使用
BioRender.com 创建。我们还要感谢智利大学显微镜部门以及智利天主教大学的高级显微镜部门。
