《Bioelectrochemistry》：Developing fast scan cyclic voltammetry at carbon fiber microelectrodes to quantify short chain fatty acids in situ
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短链脂肪酸（SCFAs）代谢动力学研究：基于碳纤维微电极快速循环伏安法的原位检测技术开发，建立SCFAs在脑、肌肉等靶组织的动态定量方法。通过流注射分析与伏安图谱关联，发现醋酸、丙酸和丁酸在pH7.40条件下产生特征氧化还原峰，其中两个阴极峰和两个阳极峰显示法拉第响应，为代谢流定量提供新工具。
Terdha Narla|Uma Nudurupati|欧阳阳光
佛蒙特大学化学系，82 University Place，Burlington，VT 05405，美国
摘要
乙酸、丙酸和丁酸是短链脂肪酸（SCFAs），也是肠道细菌产生的最丰富的代谢物。为了揭示它们在全身各部位的代谢机制，测量大脑、肌肉和皮肤等作用部位的SCFA快速流动量至关重要。目前的方法主要集中在粪便和血浆的检测上，但这些检测得到的SCFA水平较低，无法代表组织特异性浓度或流动量。因此，需要一种快速的原位检测方法。碳纤维微电极（CFMs）上的快速扫描循环伏安法（FSCV）具有所需的时空分辨率，可以满足这一需求。然而，到目前为止，人们尚未研究CFMs对SCFAs的电化学响应。通过将FSCV与每种SCFA的流动注射分析相结合，我们发现循环伏安图中每种脂肪酸都有独特的峰。其中一些峰在扫描速率、保持电位和切换电位实验中表现出法拉第行为。有趣的是，我们发现了一些对浓度敏感的峰，这些峰有望成为SCFA动态和流动量的可量化标志物。这项工作为理解CFMs对脂肪酸的响应奠定了基础，并展示了FSCV在原位定量SCFA方面的实用性。
引言
人类胃肠道中栖息着多种细菌，这些细菌产生的代谢物对宿主的代谢、免疫、大脑健康等功能有重要贡献[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。虽然肠道细菌参与了多种代谢物的从头合成，但其中最主要的代谢物是通过细菌发酵膳食纤维产生的[8]、[9]、[10]、[11]。在这些发酵副产物中，乙酸、丙酸和丁酸最为丰富[12]。这些短链脂肪酸（SCFAs）一旦产生，就会被结肠细胞迅速吸收，用于能量代谢或释放到全身循环系统中，然后被运输到大脑、肌肉和皮肤等目标组织[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。关于膳食纤维对宿主益处的研究大多关注粪便、血清或结肠中的SCFA浓度[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]。这些浓度因身体部位（血液中约为80–375 μM，粪便样本中约为12–210 mM）和患者种族而异[24]。有趣的是，SCFA浓度的增加与膳食纤维带来的益处并无关联[25]、[26]、[27]。甚至有研究表明，粪便中的SCFA浓度与女性的代谢风险因素（如肥胖度和腰围）呈正相关[28]。后来发现，稳态盲肠或粪便中的SCFA浓度并不一定代表其吸收、产生或向其他器官的运输量[14]、[18]。因此，SCFA的流动量而非浓度，才是膳食纤维带来益处的主要因素。
然而，测量体内的流动量具有挑战性。目前体外测量SCFA流动量的方法是通过向肠道微生物群添加膳食纤维来实现的。尽管这种方法提供了重要数据，但它会降低肠道微生物群的多样性，并且不能模拟体内原材料的代谢过程[18]、[29]、[30]。此外，由于去除了宿主及其吸收机制，发酵产物容易在体内积累[18]、[29]、[30]。一种有效的体内定量SCFA流动量的方法是向盲肠中注入13C标记的SCFAs，并通过气相色谱-质谱法测定其浓度[18]。尽管这种方法有一定参考价值，但它需要复杂的样品制备过程，并且需要使用昂贵的13C标记的SCFAs。此外，这种方法缺乏测量体内快速SCFA流动量所需的时空分辨率。例如，在大鼠颈动脉中注射14C-丁酸后15秒内，大脑中的SCFA浓度就已经达到了血浆水平的46%[31]、[32]。
碳纤维微电极（CFMs）上的快速扫描循环伏安法（FSCV）是一种有前景的技术，可以填补这一技术空白。由于其100 ms的时间分辨率，它适用于测量体内半衰期短、释放或再吸收动力学快的分析物[33]、[34]、[35]。由于该方法进行了背景校正，因此非常适合测量流动量[36]、[37]。CFMs体积小（通常直径为7 μm），具有生物相容性，在体内植入过程中不会引发免疫反应或组织损伤[38]。施加高正电位可以清除CFMs表面的杂质，从而实现连续监测[37]。碳的高吸附性使得分析物能够预先浓缩，使该方法具有很高的灵敏度（通常检测限可达nM级别）[39]。
为了利用FSCV在SCFA流动量测量中的优势，我们首先需要评估CFMs对脂肪酸的响应。在这里，我们使用FSCV研究了pH 7.40条件下碳纤维对乙酸、丙酸和丁酸的电化学响应，因为这一pH值代表了大脑和其他作用部位的pH值。在生理pH值（7.40）下，这些脂肪酸主要以碱形式存在。所有标准品都是通过将相应的碱溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中制备的。据我们所知，这是首次研究CFMs对脂肪酸的电化学响应。我们观察到，乙酸、丙酸和丁酸的循环伏安图（CVs）包含一个低电位的阴极峰和两个低电位的阳极峰。丙酸和丁酸还额外有一个阳极肩峰，而乙酸则没有这个峰。至少有两个峰在扫描速率实验中表现出法拉第行为，有望作为SCFA的定量标志物。我们的CVs中还出现了一个第三个阳极峰，我们认为这是由于切换电位引起的。我们通过改变保持电位和切换电位进行了进一步实验。我们还为每种SCFA生成了校准曲线，并报告了检测限和灵敏度。有些峰对某些脂肪酸更敏感，有望用于选择性定量。尽管还需要进一步的工作来提高碳纤维对不同SCFA的灵敏度和选择性，但这项工作为未来的研究奠定了基础，并展示了FSCV在SCFA定量中的实用性。
化学试剂
除非另有说明，所有化学试剂均购自Krackeler Scientific（纽约州奥尔巴尼）。所有溶液均使用电阻为18.2 MΩ cm?1的纳米纯水（Milli-Q，MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿）配制。1×磷酸盐缓冲盐水（PBS，Sigma Aldrich）是通过将五片PBS片剂溶解在1 L纳米纯水中制备的（MilliporeSigma，马萨诸塞州伯灵顿）。使用pH计（Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）测量PBS的pH值，并根据需要调整至pH 7.40。PBS用于...
SCFAs的循环伏安图（CVs）
在FSCV中，一组电位（称为波形）以高速（10 Hz）施加到CFM表面，以氧化和还原目标分析物，从而加快反应速率并减少干扰反应，并将目标分析物预先浓缩到电极表面[36]、[40]。我们和其他研究者已经利用由此产生的阴极和阳极电流来定量电活性物质[33]、[36]、[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]、[46]、[47]。在这里，我们进行了...
结论
我们证明了可以使用快速扫描循环伏安法在碳纤维表面电化学检测SCFAs。循环伏安图显示两个峰（Ox 1和Red 1），根据扫描速率、保持电位和切换电位实验的结果，这两个峰表现出法拉第行为。另外两个峰（反向扫描时的Ox 2和正向扫描时的Ox 3）可能是非法拉第峰。
CRediT作者贡献声明
Terdha Narla：撰写——初稿、可视化、验证、研究、数据分析、概念化。Uma Nudurupati：撰写——审阅与编辑、数据分析。欧阳阳光：撰写——审阅与编辑、可视化、监督、资金获取、数据分析、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢William Geiger博士和Lior Sepunaru博士在数据分析方面的帮助，感谢Jacob Kay在初步实验中的协助，以及佛蒙特大学提供的资金支持。
