综述：氧化还原酶的电化学：从功能性酶的固定到酶促生物电化学装置（教程）

《Bioelectrochemistry》：Electrochemistry of redox enzymes: from functional enzyme immobilization to enzymatic bio-electrochemical devices (tutorial)

红氧化酶电化学机制及其在生物燃料电池和传感器中的应用研究。摘要介绍了酶的结构特性、电子传递机制（直接与间接）、电化学分析方法（循环伏安法）及其在生物电化学装置中的应用，强调酶固定化技术对电子转移效率的影响，并指导实验设计与数据分析。

　　

A. Guessab|I. Mazurenko|E. Lojou|A. de Poulpiquet

法国马赛大学，法国国家科学研究中心（CNRS），BIP生物能源与蛋白质工程实验室，UMR 7281，地址：31 Chemin Joseph Aiguier，邮编70071 13402，马赛Cedex 09

摘要

氧化还原酶的电化学是一个多学科领域，加入生物电化学实验室的学生背景各异：化学、生物学、生物技术、纳米技术、物理学等，因此他们在相关学科上的水平往往参差不齐，有时缺乏项目所涉及领域的基础知识（如物理化学、电化学、酶学等）。尽管这些项目汇集了来自不同领域的经验丰富的研究人员，但合作伙伴之间仍可能存在理解上的不足。本教程基于法国生物电化学小组（GFB）首届冬季学校上的讲座编写，旨在为新手提供指导，并推荐更深入的专业文献。教程介绍了氧化还原酶及其在电极上的固定化方法，解释了直接和间接电子转移的机制，还讲解了一种重要的电化学方法——循环伏安法，并描述了如何从酶/电极和催化反应中提取信息。最后，教程介绍了两种生物电化学装置：酶燃料电池和酶生物传感器，并提供了它们的电化学表征方法。

引言

氧化还原酶（EC 1.X.X.X）是一类能够催化多种代谢过程中氧化还原反应的生物分子（如呼吸作用、发酵等）。由于其对底物具有极高的选择性和敏感性以及极高的催化效率，它们是非常出色的催化剂。此外，这些酶在水中可大量生产且可生物降解，并且通常能在温和的pH值和温度条件下工作，这使得它们成为生物技术装置中的理想成分，主要应用于诊断、能源和环境领域[1]。

与所有蛋白质一样，氧化还原酶由多肽骨架组成，即氨基酸链，这些氨基酸链通过二级结构（α螺旋和β折叠）形成三维结构。有时多个酶会组装成多聚体（二聚体、三聚体等），从而形成四级结构。球状酶的直径可达几纳米，而单个分子的分子量大约在10到100 kDa之间。这些酶的独特之处在于其活性位点，催化反应就在这里发生。活性位点通常包含一种氧化还原辅因子，可以是金属络合物（如Cu、Mo、Co、Fe、NiFe等）或有机分子（如黄素、醌）。

酶的催化效率取决于活性位点降低反应能量障碍的能力，同时也依赖于分子内部和分子间的快速电子转移。大多数情况下，催化中心深埋在蛋白质结构中，因此需要将电子从位于蛋白质表面的氧化还原中心传递到反应位点，以便与底物或生理伴侣进行反应。这里所说的“底物”是指可以被酶氧化或还原的有机或无机分子；“生理伴侣”则是指与酶相互作用的氧化还原蛋白。分子内的电子转移路径可能涉及一系列氧化还原辅因子（例如氢化酶中的铁硫簇），或者高电子密度的氨基酸（如组氨酸），它们在多铜氧化酶中起到电子传递的作用。电子通过隧道效应在相邻辅因子之间传递，平均传输距离约为10 ? [2]。

在自然界中，催化反应和分子内的电子转移与酶与其生理伴侣或共底物之间的分子间电子转移是耦合的。而在电化学实验中，生物催化剂被固定在导电界面（电极）上，电极替代了酶反应中的天然电子供体或受体。酶必须能够与电极建立有效的电子连接。这种连接可以直接实现（即电子通过隧道效应在酶和电极之间直接传递），也可以间接实现，此时一种称为“介质”的氧化还原分子充当电子传输体。

从基础科学和技术角度来看，将酶固定在电极上都非常有趣。电化学是一种强大的分析工具，可用于研究涉及电子转移的反应，尤其是氧化还原酶催化的反应。其主要原理是通过测量电流与电位的关系来研究酶的催化效率，即通过调节电极的电位（使其倾向于向酶提供或从酶吸收电子），并记录电子交换速率[3][4]。这种方法可以应用于多种研究，以获得关于酶反应性的精确热力学和动力学信息：热力学常数、底物亲和力、抑制作用、动力学常数及反应机制[3]。由于电极旨在模拟酶的天然电子供体或受体，因此研究界面电子转移可以揭示酶在体内的工作原理。电化学还能评估酶与电极之间的电子耦合效率，并提供关于电酶系统特性的丰富信息（如扩散和物质传输[5]）。

在生物技术和生物电化学装置中，酶可用作生物传感器中的高灵敏度生物受体[6][7]，或在生物燃料电池中替代贵金属作为高效催化剂[8]。后者还有一个优势，即酶能够以较低的过电位转化燃料和氧化剂。常规电化学方法还可用于评估燃料电池的功率和电流密度、生物传感器的选择性和灵敏度以及稳定性[8][9][10][11][12]。电合成[9]和生物电容器[8][10][11][12]领域也取得了显著进展。

酶的固定化方法有多种。最简单的方法是物理吸附：将酶溶液滴在电极表面或直接将电极浸入酶溶液中使其吸附[13]。将其封装在hydrogel或溶胶-凝胶中也比较容易；使用具有可控孔隙率的纤维素或尼龙膜将酶限制在电极附近也是稳定且简便的方法。与修饰后的电极形成共价键也能保证酶的稳定性，并可实现特定的定向排列（例如通过亲和力自组装[14][15][16]）。通过电聚合将酶捕获在聚合物中是一种可控的过程，有助于实现微型化[14][15][16]。

每种方法都有其优缺点，需要仔细考虑。固定化可能导致的常见后果包括酶的构象变化（影响其底物亲和力，由Michaelis常数K_M表示）或酶失活（导致最大反应速率V_max降低）。酶与电极/基质之间的离子、疏水或其他相互作用也会影响K_M和V_max的值。此外，溶液中的底物和/或产物浓度可能与酶附近的浓度不同，因此底物的大小对选择固定化方法至关重要[17][18]。

然而，我们认为最重要的挑战是确保酶与电极之间高效的电子传递，这对优化整个电酶系统的性能至关重要。本文将探讨酶与电极连接的相关问题及策略，分别讨论直接电子转移和间接电子转移的情况，并解释如何从电化学研究中获取信息。在第三部分中，我们将介绍两种生物电化学装置：酶燃料电池和酶生物传感器及其电化学表征方法。

电子转移效率与Marcus理论

活性位点通常深埋在蛋白质结构中，氧化还原辅因子的分布也不均匀。因此，要确定可以通过隧道效应实现直接电子转移的条件，需要了解电子转移速率随氧化还原中心间距的变化情况。根据Marcus理论，电子转移的动力学常数随氧化还原中心间距的增加而呈指数下降[19]。

$k_{\mathrm{ET}}\propto e^{?\beta \left(d?d_0\right)}{e}^{\frac{?{\left(?G^{}\right)}^{}}{}}$

酶在电极上的连接：间接电子转移（MET）

如上所述，并非所有酶都支持间接电子转移（DET）。即使某些酶支持这种转移，电极的优化也可能耗时且成本高昂。在这种情况下，可以使用氧化还原探针在蛋白质的氧化还原中心与电极之间传递电子。这种电子传递介质称为“电子转移介质”。在间接电子转移（MET）过程中，Marcus理论（方程1）仍然适用。

结论

本教程旨在引导读者了解酶-电极研究的迷人领域。我们逐步介绍了在带电界面上固定酶所面临的挑战及克服这些挑战的策略，并介绍了使用循环伏安法对固定化酶进行电化学研究的特定方法。此外，我们还扩展了讨论范围，涵盖了生物电化学装置（如酶燃料电池）的相关内容。

CRediT作者贡献声明

A. Guessab：撰写、审稿与编辑、验证。 I. Mazurenko：撰写、审稿与编辑、验证、资源提供。 E. Lojou：撰写、审稿与编辑、验证、资源提供、方法学研究、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。