风化煤与牛粪在固态厌氧共发酵过程中关键产甲烷途径的宏基因组分析

《Biomass and Bioenergy》：Metagenomic analysis of key methanogenic pathways in solid-state anaerobic co-fermentation of weathered coal and cattle manure

固态厌氧共发酵牛粪与风化煤提升生物甲烷产量及CO?还原，关键酶GH94/GT4/GH18及电子转移相关基因表达显著增强，为煤渣有机废弃物协同处理提供新机制。

　　

宋波|崔全|郭鸿宇|高宁波

西安交通大学能源与动力工程学院，中国西安

摘要

本研究利用宏基因组测序技术评估了牛粪与风化煤在固态厌氧共发酵过程中的微生物多样性和功能活性结构，旨在分析关键代谢途径。结果表明，厌氧共发酵显著提高了生物甲烷的产生量，同时显著上调了多种碳水化合物相关酶的活性，包括纤维二糖磷酸化酶（GH94）、糖基转移酶（GT4）和糖苷水解酶（GH18）。该过程通过富集2-氧代戊二酸/2-氧代酸铁氧还蛋白氧化还原酶α亚基、丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶α亚基以及甲基辅酶M还原酶β亚基，增强了微生物间的电子传递；而葡萄糖-6-磷酸异构酶和果糖-1,6-二磷酸酶II在混合底物中的纤维素降解过程中发挥了关键作用。固态厌氧共发酵主要以乙酰基断裂途径产生甲烷，并且这两种途径共同促进了CO₂的还原。本研究为风化煤和牛粪的处理提供了机制上的理解，为固体废物处理和清洁能源开发提供了新的思路。

引言

中国政府已明确宣布了到2030年实现碳峰值、到2060年实现碳中和的分阶段发展目标[1]。作为中国的主要能源之一，煤炭的清洁高效利用对于实现这些目标至关重要。风化煤是煤炭资源的一种，它经过长期地表作用后形成了物理、化学和生物变化，储量丰富但尚未得到充分利用[2]。由于其高水分和氧气含量、低热值以及较高的腐殖酸含量，直接燃烧效率低下且容易产生结渣和污染物排放等问题，严重限制了其大规模应用[3]。目前风化煤的利用方式主要包括直接燃烧发电、提取腐殖酸用于农业以及作为土壤改良剂[4]。其中，提取腐殖酸用于农业生产是最常见的方法，但这一过程能耗较高且残余副产物的管理存在挑战[5]。尽管循环流化床（CFB）燃烧技术可以适应某些低热值燃料，但风化煤的高水分含量和结渣倾向会导致进料困难、床层压力波动、燃烧不稳定以及污染物控制更加复杂。自从提出煤层气微生物生成的概念以来，研究人员尝试利用微生物群落降解和转化煤炭中的复杂有机化合物，如多环芳烃、单环芳烃、酮类和长链烷烃。然而，煤炭的高碳含量使得维持稳定的厌氧发酵环境变得困难，从而阻碍了微生物的转化。因此，开发风化煤的清洁高效转化技术成为了一个研究热点和重大挑战。

近年来，畜牧业的迅速发展导致畜禽粪便产量大幅增加，仅中国每年的牛粪产量就超过10亿吨[6]。牛粪富含有机物、氮和病原微生物，在储存或施用于土地时容易被雨水冲刷，产生渗滤液并加剧周边地区的环境负担[7]。不当管理可能导致严重的土壤污染、水体富营养化和温室气体排放。目前的处理方法主要包括好氧堆肥、厌氧发酵和直接施用于土地。好氧堆肥可以通过微生物活动将有机物转化为腐殖质，实现资源利用，但存在处理周期长、氮损失大和异味排放等问题。厌氧发酵可以产生可再生能源——沼气，但发酵残渣的处理仍然具有挑战性，且高氨氮水平可能抑制微生物活性。虽然直接施用于农田操作简单，但重金属和抗生素残留物的问题阻碍了其大规模应用。

为了提高牛粪中有机物的转化效率、减少污染物排放、促进能源回收、支持农业绿色发展并实现“双碳”目标，牛粪与风化煤的固态厌氧共发酵成为了一种有前景的协同处理策略。牛粪富含氮源和易降解的有机物，可以有效优化发酵系统的碳氮（C/N）比例，为微生物提供均衡的营养。此外，其自身的厌氧微生物群落是功能性微生物的天然库。同时，风化煤具有多孔结构和较高的腐殖酸含量，可以吸附氨氮，减轻抑制作用，并在发酵过程中增强微生物群落的稳定性。厌氧发酵中功能基因和酶的表达对于调控挥发性脂肪酸（VFA）的产生和底物代谢（如碳水化合物和蛋白质）至关重要。因此，对微生物群落的宏基因组分析有助于深入了解这些降解过程中的协同和拮抗作用，最终提高生物甲烷生产的效率和稳定性。

在基因层面的分析将为风化煤与牛粪固态共发酵的代谢途径提供更深入的见解。然而，关于共发酵的基因水平研究仍然有限，功能酶的基因表达与特定微生物之间的关系尚不明确。宏基因组学方法常用于研究复杂有机化合物厌氧发酵过程中甲烷代谢和相关功能酶的特性。基于此，本研究探讨了风化煤与牛粪共发酵过程中微生物群落结构的变化以及参与甲烷代谢的功能基因的宏基因组变化。这为全面理解固态厌氧发酵过程中甲烷生成和代谢的促进机制奠定了基础，从而扩展了风化煤和牛粪转化为生物甲烷的潜在应用。

材料

煤样选自山西省晋城的风化煤，在45°C下干燥8小时，然后存放在密封环境中。新鲜干燥的牛粪从养牛场收集，并在低温条件下储存在密封容器中。样品的水分含量和元素分析遵循ISO 17247-2013标准，结果见表S1。风化煤（53.1）与牛粪的碳氮比存在差异

差异微生物群落和代谢途径分析

在固态厌氧共发酵过程中，微生物的代谢功能与有机物的有效转化密切相关。高通量测序技术用于分析微生物群落结构的变化，以研究联合固态厌氧发酵过程中古菌和细菌的变化（图1）。联合固态厌氧发酵产生的生物甲烷量为1000 mL

结论

研究结果表明，固态厌氧共发酵显著增强了产甲烷代谢途径的整体活性，特别是CO₂还原途径的相对丰度显著增加。通过甲基辅酶M还原酶（mcrA编码）和辅酶B（HS-CoB）的协同作用，最终甲烷的释放显著增强，从而大幅提高了系统的甲烷产量。

CRediT作者贡献声明

宋波：撰写——初稿。崔全：撰写——审稿与编辑。郭鸿宇：指导。高宁波：撰写——审稿与编辑。

致谢

作者衷心感谢以下机构的资助：国家自然科学基金（编号：42172195、42372202）、西安市科技项目（编号：2024JH-CXSF-7090022）。本研究还得到了河南省杰出青年学者科学基金（编号：222300420008）、河南省高校重点科研项目（编号：23ZX015）以及河南工业大学创新科研团队（编号：T2023-1）的支持。