一种具有抗菌、抗氧化和免疫调节功能的壳聚糖-茶多酚复合水凝胶，用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的伤口组织再生

《Bioorganic Chemistry》：A chitosan-tea polyphenol composite hydrogel with integrated antibacterial, antioxidant and immunomodulatory functions for the tissue regeneration of MRSA-infected wounds

pH响应型Ag@EGCG/Chitosan-EGCG水凝胶通过协同抗菌、抗氧化及免疫调节作用加速MRSA感染伤口愈合，有效抑制生物膜形成并降低氧化应激损伤。

　　

曾珍|康丽媛|何彦杰|关媛媛|曹玉洲|张欣茹|袁伟恩

上海交通大学药学院细胞与治疗性抗体工程研究中心，教育部，中国上海200240

摘要

尽管基于银的创可贴在临床实践中被广泛使用，但大多数创可贴的功能有限，无法满足不同愈合过程的需求。因此，我们通过将壳聚糖和EGCG交联，并嵌入Ag@EGCG纳米颗粒，制备了一种多功能Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶，用于治疗感染性伤口。与大多数被动释放银离子的商业创可贴不同，Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶具有pH响应性的释放行为：在酸性条件下，Ag@EGCG纳米颗粒从水凝胶中释放出来，增加局部活性氧（ROS）从而发挥杀菌作用。该水凝胶不仅抑制了MRSA生物膜的形成，更重要的是，还能破坏成熟的生物膜。同时，它还能有效缓解伤口部位的氧化应激，促进细胞增殖和迁移。在MRSA感染伤口的小鼠模型中，Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶促进了M2型巨噬细胞的极化，并下调了促炎细胞因子（IL-6、TNF-α），显著加速了伤口愈合。此外，它在体内表现出优异的安全性，同时有效清除了伤口中的MRSA。总之，Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶凭借其强大的抗菌、抗氧化和免疫调节特性，成为治疗感染性伤口的有希望的平台。

引言

伤口护理带来了巨大的临床和经济负担[1]。2022年全球伤口护理市场价值为201.8亿美元，预计到2030年将达到305.2亿美元，这凸显了伤口管理日益增长的经济压力[2]。某些人群的伤口愈合风险更高，包括免疫力低下者、合并症患者（例如糖尿病、神经病变患者）以及老年患者[3]。伤口通常经历一个复杂的生理愈合过程，包括炎症、增殖和重塑[4]。持续的感染会延长炎症时间，同时抑制肉芽组织形成和上皮再生，从而导致慢性伤口的发展[5]。在临床实践中，抗生素通常是治疗各种感染的有效手段。然而，抗生素的过度使用导致了抗生素耐药性的出现。世界卫生组织（WHO）已将抗菌素耐药性确定为重大的全球健康威胁[3]。生物膜中的密集细胞外聚合物基质，加上酸性的微环境和升高的酶活性，使得传统抗生素失效[6]。因此，生活在生物膜中的细菌对抗生素的耐药性可能比浮游细菌高1000倍[7]。此外，这些受保护的细菌群落能够逃避宿主的免疫防御机制，从而引发持续的慢性感染[8]。在伤口微环境中，早期激活的炎症细胞（尤其是中性粒细胞）会产生高水平的ROS[9]。这种氧化爆发有助于清除入侵的病原体并启动愈合过程[10][11]。然而，当ROS的产生超过内源性抗氧化系统的清除能力时，就会发生氧化应激[12]。这不仅会直接损害关键的修复细胞（例如成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞），还会进一步放大炎症信号[13][14][15]。巨噬细胞的极化是一个重要的免疫调节过程，但持续的氧化应激和细菌感染会严重破坏这一过程[9]。过多的ROS会抑制M2型巨噬细胞的激活，从而损害组织修复[16]。细菌感染会长期刺激M1型巨噬细胞的极化，导致促炎细胞因子和基质金属蛋白酶（MMPs）的过度产生，这些物质会降解细胞外基质[17]。愈合过程因此陷入促炎状态，而无法正常进入增殖阶段，最终导致慢性伤口的形成[18]。慢性伤口与巨噬细胞从促炎状态向抗炎状态的表型转变受损密切相关。因此，设计能够控制感染、管理氧化应激和调节免疫反应的多功能创可贴至关重要，特别是对于难以愈合的伤口，如生物膜感染、糖尿病足溃疡和烧伤。

开发新型抗菌纳米材料以减少药物耐药性是目前最有前景的研究方向之一[3][19]。银纳米颗粒（Ag NPs）在伤口护理中显示出特别的前景，因为它们具有公认的抗菌效果、广泛的应用前景和高的商业可行性[15][20][21][22][23][24]。然而，Ag NPs也有一些局限性，包括功能有限、聚集问题、快速释放以及潜在的毒性[25]。尽管Ag NPs具有广谱抗菌活性，细菌仍可以通过多种机制对其产生耐药性。因此，基于银的创可贴的主要目标是开发新的策略，以减少耐药性的产生并尽量减少毒性副作用。先前的研究表明，可以用生物相容性聚合物（如聚乙二醇（PEG）或壳聚糖）修饰Ag NPs的表面，从而改善其抗菌性能[26]。此外，绿色合成方法用于制备基于银的创可贴已成为解决毒性问题的有希望的方法[27][28]。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是绿茶中的主要儿茶素，因其多种作用而受到关注，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗病毒作用[29]。EGCG是由黄烷-3-醇和没食子酸形成的酯，其B环和D环上各有三个相邻的酚羟基。氧化的EGCG可以与细菌蛋白质的巯基结合形成醌-蛋白质复合物。这些醌-蛋白质复合物不仅会破坏细菌的氧化还原平衡，还会使含有活性半胱氨酸的功能酶失活，最终导致细菌死亡[30]。因此，EGCG介导的Ag NPs的原位还原有望同时提高抗菌效果并降低细胞毒性。

水凝胶因其优异的亲水性、生物降解性和保湿能力而成为重要的组织工程材料[31][32]。壳聚糖是一种天然的阳离子多糖，具有固有的抗菌活性、生物相容性和止血功能。这些特性使其成为多功能水凝胶敷料的理想基质[33][34][35]。最近，壳聚糖-多酚复合水凝胶引起了广泛关注，因为它们结合了壳聚糖的生物相容性和抗菌活性以及多酚的强抗氧化性能，形成了有前景的伤口愈合平台。然而，壳聚糖-多酚水凝胶的应用受到多种因素的限制，包括制备过程复杂、生物相容性差以及需要外加交联剂[36][37]。因此，伤口护理的一个重要目标是开发一种制备简单且安全性高的多功能壳聚糖-多酚水凝胶。

在这里，我们设计了一种基于银的壳聚糖-茶多酚水凝胶，通过协同发挥抗菌、抗氧化和免疫调节作用来加速感染伤口的愈合。在本研究中，我们选择EGCG作为还原剂和稳定剂来制备Ag@EGCG纳米颗粒。Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶通过简便的方法合成，无需额外的交联剂。在酸性伤口条件下，Ag@EGCG纳米颗粒从水凝胶中释放出来，并通过产生ROS有效发挥抗菌作用。该水凝胶不仅有效抑制了MRSA生物膜的形成，更重要的是，还能破坏成熟的生物膜。由于其高EGCG含量，Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶能够有效缓解氧化应激，从而促进细胞增殖和迁移。在MRSA感染伤口的小鼠模型中，Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶在促进伤口快速收缩和功能性组织再生方面表现出极高的效果。该水凝胶促进了M2型巨噬细胞的极化，下调了促炎因子IL-6和iNOS，上调了VEGF的表达。因此，基于银的壳聚糖-茶多酚水凝胶平台为复杂伤口愈合（如MRSA生物膜感染伤口）提供了有希望的治疗方法。

材料

（?）表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG，98%）和硝酸银（AgNO₃，99%）购自新华药业试剂有限公司。壳聚糖（CS，脱乙酰度≥95%，分子量50–60 kDa）从上海麦克林生化有限公司订购。氢氧化钠（NaOH，97%）由Sigma-Aldrich公司提供。细胞计数试剂盒-8（CCK8）、活性氧（ROS）检测试剂盒、LIVE/DEAD细菌染色试剂盒（含DMAO和PI）以及Calcein/PI细胞活力/细胞毒性检测试剂盒也用于实验。

Ag@EGCG纳米颗粒的合成与表征

Ag@EGCG纳米颗粒是在室温下通过将EGCG与AgNO₃在碱性溶液中混合合成的。这种简便的方法利用EGCG在温和条件下完成还原和稳定，提供了一种安全且经济的合成途径。选择EGCG不仅是因为其固有的抗菌、抗炎和抗氧化活性，更重要的是因为其酚羟基的还原和配位能力[38]。

Ag@EGCG纳米颗粒呈球形

结论

在本研究中，我们设计了一种多功能Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶，通过协同发挥抗菌、抗氧化和免疫调节作用来促进伤口愈合。Ag@EGCG纳米颗粒在酸性伤口条件下从水凝胶中释放出来，生成ROS以杀死细菌并破坏MRSA生物膜。Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶可以有效去除多余的ROS，从而促进细胞增殖和迁移。在体内，Ag@EGCG/壳聚糖-EGCG水凝胶不仅

CRediT作者贡献声明

曾珍：撰写——原始草稿、资源准备、方法设计、数据分析、数据整理。康丽媛：验证、方法设计、数据分析、数据整理。何彦杰：数据可视化、资源准备、方法设计、数据分析。关媛媛：验证、方法设计、数据分析、数据整理。曹玉洲：撰写——审稿与编辑、数据整理。张欣茹：撰写——审稿与编辑、数据整理。袁伟恩：撰写——审稿与编辑、监督、项目指导

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：82473876）和上海交通大学医学工程交叉基金（编号：YG2026QNB26和YG2025QNA36）的财政支持。我们感谢上海交通大学仪器分析中心教师们的帮助。