新型单糖TLR4激动剂的设计、合成及其免疫学评估

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis and immunological evaluation of novel monosaccharide TLR4 agonists

本研究设计并合成了三聚糖MPLA类似物GAP210、GAP212和GAP214，通过调整C-2和C-3位次级酰链长度，发现GAP214作为疫苗佐剂在三次免疫后显著提高IgG水平达2.5倍，表明其作为高效TLR4激动剂的潜力。

　　

张志明|文宇|罗梦强|孙海龙|丁东|廖春苗|郭军

中国中部师范大学化学学院，绿色农药国家重点实验室，智能生物传感技术与健康国际联合研究中心，武汉430079，中国

摘要

单磷酸脂质A（MPLA）是一种Toll样受体4（TLR4）激动剂，已被用于多种获批的人类疫苗中作为佐剂。然而，MPLA复杂的二糖结构给化学合成带来了显著挑战。为了解决这一限制，我们设计了一系列基于葡萄糖胺的烷基4-磷酸（GAP）化合物。这些化合物是单糖脂质A的类似物，通过用N-二氨基烷基糖苷单元替换MPLA中的还原性葡萄糖胺二糖来合成。通过调节非还原性糖的C-2和C-3位置的二级酰链长度，成功合成了三种新型TLR4激动剂：GAP210、GAP212和GAP214，并随后将其作为疫苗佐剂进行了评估。结果表明，二级酰链的长度显著影响了免疫激活效果。值得注意的是，在三次免疫后，GAP214佐剂组的IgG水平比阳性TLR4激动剂对照组高出2.5倍。这些发现表明GAP类似物是有效的TLR4激动剂，是开发疫苗佐剂的理想候选物。

引言

佐剂是加入疫苗中的免疫刺激物质，用于增强免疫反应的强度、持久性和质量。通过调节先天性和适应性免疫，佐剂可以显著提高对共施用抗原的免疫反应，从而减少所需的抗原剂量。此外，佐剂还可以被设计为引发特定类型的免疫反应，从而优化对多种感染的防护[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]。目前，在FDA批准用于人类的众多疫苗中，仅使用了有限几种佐剂，包括铝盐、MF59、AS01、AS03、AS04、CpG 1018和Matrix-M。AS01、AS02、AS04和AS15是由葛兰素史克（GSK）开发的四种不同的佐剂系统，均以MPL?为核心成分。MPL?是由不同同系物组成的复杂混合物，其中六酰基成分被认为是最活跃的部分[7]、[8]。MPLA来源于Salmonella Minnesota R595 (S. R595)的LPS，通过温和的水解R-3-羟基十四酰基和1-磷酸基团制备而成，其组成与MPL?相似。与LPS相比，MPLA的毒性显著降低，同时保留了强大的免疫刺激特性[9]。作为一种安全且有效的佐剂，MPLA已广泛应用于预防和治疗疾病，包括带状疱疹[10]和疟疾[11]。然而，从细菌培养物中提取的脂质A的固有异质性，加上可能存在的其他促炎细菌成分的污染，给获得具有药用级纯度和稳定性的天然脂质A带来了重大挑战[12]、[13]。这些限制阻碍了对脂质A在分子水平上的结构-活性关系和功能机制的全面研究。因此，化学合成是一种可行的方法，可以获得结构明确、纯度高的这些高度复杂的脂质A形式。

Kusumoto及其研究小组[14]、[15]、[16]首次合成了脂质A的生物合成前体，验证了脂质A的基本骨架结构，并阐明了磷酸基团在其生物活性表达中的关键作用。在此基础上，该团队进一步完成了天然大肠杆菌 (E. coli)脂质A的首次全合成，并最终从化学角度确认了脂质A的完整生物活性结构，为磷酸化六酰基二糖（PHAD）的精确六酰基修饰研究奠定了坚实的方法论和理论基础。作为MPLA的一种明确、完全合成的类似物，PHAD现已广泛应用于疫苗相关研究和配方开发[17]、[18]。近年来，在MPLA的化学合成研究方面取得了显著进展。研究人员建立了多种成熟的合成路线，并进行了一系列优化工作，重点关注结构精度和合成可扩展性[19]、[20]、[21]。然而，MPLA的化学合成仍面临许多挑战：总体合成路线相对复杂，对反应条件和纯化过程有严格的要求，这在一定程度上限制了MPLA的后续开发和实际应用[22]。为了简化分子结构并降低合成复杂性，研究人员基于单糖骨架开发了TLR4激动剂[23]。几种含有非还原性葡萄糖胺的单糖TLR4激动剂，包括AGP[24]、PET-A[25]和FP系列化合物[26]、[27]，表现出强烈的激动活性。研究表明，含有非还原性葡萄糖胺的单糖结构在免疫系统激活方面比含有还原性葡萄糖胺的结构更有效[13]。同时，脂质A的生物活性与其脂肪酸链的长度、分布和化学性质以及负电荷磷酸基团的存在密切相关[28]、[29]。来自大肠杆菌的脂质A具有6个碳原子的脂肪酸链，表现出强大的免疫刺激活性。改变脂肪酸侧链的数量和长度可以显著降低人体细胞中的信号强度[30]。这归因于参与MD-2与TLR4胞外域结合的关键氨基酸序列的保守性，以及脂质A的疏水性，使其对酰基化和酰链长度非常敏感。此外，TLR4/MD2复合物形成的疏水口袋空间容量有限，脂质A侧链长度的变化可以调节其与TLR4/MD2的结合亲和力，从而影响其生物活性[31]、[32]、[33]。最后，二级酰链的长度比磷酸基团的数量对脂质A的生物活性更为关键[34]、[35]。缺乏二级酰链的脂质A可能会完全失去其激动活性，突显了这些结构特征的重要性[36]。TLR4信号传导通过两条不同的下游途径进行，即MyD88依赖途径和TRIF依赖途径[37]、[38]。MyD88途径主要促进促炎细胞因子的产生，而TRIF途径有助于I型干扰素的产生和交叉呈递，这两者对于建立强大的适应性免疫和提高疫苗效力都是必不可少的[39]、[40]。MPLA是一种典型的TLR4激动剂，表现出TRIF偏向的信号传导特征，其特征是减弱了MyD88介导的炎症反应，同时保持了有效的TRIF依赖性免疫激活[41]、[42]。这种偏向的信号传导被认为对疫苗佐剂是有利的，可以提高安全性并实现理想的免疫极化。

因此，我们基于GAP112设计并合成了一系列结构简化的单糖MPLA类似物，GAP112是对来自S. R595的糖脂进行结构修饰得到的[43]、[44]。这些类似物保留了非还原性单糖和C-4磷酸基团以及来自大肠杆菌的糖脂的两个独立的14碳原子单酰链。通过结构修饰，将非还原性葡萄糖胺的C-2和C-3位置的二级酰链长度分别修改为10、12和14个碳原子。这种修饰旨在研究二级酰链长度对生物活性的影响，所得化合物分别命名为GAP210、GAP212和GAP214（图1D）。我们使用卵清蛋白（OVA）作为模型抗原，PHAD和三种新型分子作为佐剂，评估它们在小鼠模型中对体液和细胞免疫反应的影响。由于这些合成脂质A类似物具有高疏水性，我们将它们制成脂质体进行进一步评估。结果表明，与PHAD相比，这些结构更简单的单糖化合物在激活小鼠免疫系统方面表现出更优的效果，为设计高效TLR4激动剂提供了宝贵的见解。（见方案1。）

部分摘录

GAP210、GAP212和GAP214的制备

GAP210、GAP212和GAP214的合成包括四个关键步骤：脂质链合成、糖基供体合成、糖基受体合成和糖基化后的修饰。具体来说，不同长度的二级侧链脂肪酸S7-S9和Nap保护的活性酯S12是通过五步法从Meldrum酸（方案S1）[45]合成的。糖基受体是通过五步羟基保护基团转化从戊糖醇合成的，最终

结论

在这项研究中，我们设计并合成了三种新型单糖脂质A类似物：GAP210、GAP212和GAP214。这些化合物的结构比PHAD更简单，同时在体外和体内都表现出强大的免疫刺激特性。实验结果表明，这些类似物在先天性和适应性免疫方面具有与PHAD相当甚至更强的免疫原性。具体来说，GAP214?+?OVA诱导的IgG抗体水平比PHAD高出2.5倍

CRediT作者贡献声明

张志明：撰写——原始草稿，研究，概念构思。文宇：研究。罗梦强：研究。孙海龙：研究。丁东：研究。廖春苗：研究。郭军：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（92578121、22477039、22177035）、中央高校基本科研业务费（CCNU25JC034）以及中国高校学科引才计划（111计划）（B17019）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。