《Bioorganic Chemistry》：Discovery of chalcone derivatives as antileishmanial agents: Phenotypic screening, exploratory docking and enzymatic assays on trypanothione reductase and related flavoproteins
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本文针对当前利什曼病治疗面临的毒性、耐药性和给药不便等挑战，报道了一项旨在开发新型、高选择性抗利什曼病药物的研究。研究人员聚焦于查耳酮类天然产物及其衍生物，通过系统的表型筛选、计算机模拟对接和体外酶学实验，评估了25个化合物对利什曼原虫（包括婴儿利什曼原虫、杜氏利什曼原虫、热带利什曼原虫和大型利什曼原虫）的抑制作用。研究发现，化合物1、2、5和12在抑制前鞭毛体和细胞内无鞭毛体增殖方面表现出强效且具高选择性的活性。其中，化合物1和5还能有效抑制被感染巨噬细胞中IL-β、IL-18和IL-10等细胞因子的释放，显示出潜在的免疫调节功能。通过计算机对接模拟，研究预测了这些化合物与寄生虫特有的锥虫硫酮还原酶（TR）等黄素蛋白辅酶结合位点的高亲和力，为理解其作用机制提供了线索。该研究不仅鉴定出具有开发前景的抗利什曼病先导化合物，也为后续靶向寄生虫氧化还原稳态的药物设计奠定了基础。
在热带和亚热带地区，一种由利什曼原虫引起的、名为利什曼病的被忽视寄生虫病，正威胁着上亿人口。其临床表现从可自愈的皮肤溃疡，到致命的内脏损害，治疗却一直步履维艰。现有药物如五价锑剂、两性霉素B等，常常因毒性大、易产生耐药、价格昂贵或给药困难而让人望而却步。与此同时，气候变化和人类活动正悄然改变着该病的流行地图，使其向新的地域蔓延，开发更安全、有效、可及的新型疗法迫在眉睫。
在这一背景下，意大利博洛尼亚大学的研究团队将目光投向了自然界。植物次级代谢产物查耳酮，因其多样的生物活性，一直是药物化学领域的“明星骨架”。尤其是一些天然存在的查耳酮，如甘草查耳酮A，已被证实具有良好的抗利什曼原虫活性。那么，能否通过对这一“特权结构”进行理性设计和改造，得到具有更高活性、更低毒性的候选药物呢？这便构成了本研究探索的核心。相关成果发表在《Bioorganic Chemistry》杂志上。
为了回答这一问题，研究人员综合运用了化学合成、体外生物活性评价、计算机模拟和酶学分析等多种关键技术。他们首先基于先前发现的先导化合物，通过修改A环和B环的取代基，合成了一个包含25个查耳酮及其相关衍生物的化合物库。在表型筛选层面，利用体外细胞模型，系统评估了这些化合物对多种利什曼原虫前鞭毛体和在人源巨噬细胞内的无鞭毛体的抑制活性（IC50测定），并测定了其对人类巨噬细胞的细胞毒性（CC50测定），以计算选择性指数（SI）。在免疫学层面，通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测了化合物对巨噬细胞关键细胞因子释放的影响。在机制探索层面，他们进行了计算机分子对接模拟，预测了候选化合物与利什曼原虫的锥虫硫酮还原酶（Trypanothione Reductase, TR）及其他几种黄素/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（FAD/NAD(P)H）依赖性脱氢酶（如二氢硫辛酰胺脱氢酶DLD、II型NADH脱氢酶NDH2、烯酰基辅酶A还原酶deCoAR）辅酶结合口袋的亲和力。最后，他们通过体外酶促反应实验，测定了候选化合物对重组表达的婴儿利什曼原虫TR和作为参照的嗜热梭菌NDH2酶活性的直接影响。
2.1. 设计策略
研究团队在前期工作基础上，对已知的先导查耳酮进行了系统的结构修饰。策略包括：保留查耳酮骨架，分别在A环（苯乙酮部分）的2,4或4位引入不同的取代基（如炔丙氧基、甲氧基、3,3-二甲基烯丙氧基等），在B环（苯甲醛部分）引入不同性质的芳基（如4-硝基苯基、2,4-二氯苯基、4-氟苯基、吡啶及其烷基吡啶鎓盐等）。同时，他们还探索了将查耳酮开链结构环化为黄酮醇、芳亚甲基四氢萘酮、色满酮等结构类似物，以研究骨架本身对活性的影响。
2.2. 合成
通过克莱森-施密特缩合反应等经典方法，成功合成了目标化合物库，并对其中部分化合物使用了绿色化学合成策略。
2.3. 体外生物学检测结果
2.3.1. 对婴儿利什曼原虫前鞭毛体代谢活性的抑制和细胞毒性
对25个查耳酮及相关衍生物的筛选结果显示，多个化合物表现出优异的抗前鞭毛体活性。其中，化合物1、2、5和12脱颖而出，它们不仅对婴儿利什曼原虫具有强效抑制活性（IC50值在4.6至16.4微摩尔之间），而且对人类的U937巨噬细胞毒性很低，因此获得了优异的选择性指数（SI > 10）。结构-活性关系分析表明，A环的2,4-二烷氧基取代模式是保持抗利什曼活性的关键结构特征。将查耳酮骨架环化为黄酮醇（化合物23）后仍保持了活性，但其他环化结构（如化合物20-22）则基本失活。
进一步评估发现，这四种先导化合物对其他几种重要的致病性利什曼原虫（如杜氏利什曼原虫、热带利什曼原虫、大型利什曼原虫）的前鞭毛体也具有广谱的抑制活性。
2.3.2. 对无鞭毛体复制的抑制
无鞭毛体是寄生虫在哺乳动物宿主体内的致病形式。在感染了利什曼原虫的巨噬细胞模型中，四种先导化合物同样能有效抑制无鞭毛体的增殖，IC50值在8.5至12.9微摩尔之间，并保持了良好的选择性。尤其值得注意的是，它们对另外三种利什曼原虫（杜氏、热带、大型）的无鞭毛体也表现出强效抑制，其中化合物1对大型利什曼原虫无鞭毛体的抑制活性最高。
2.4. 对细胞因子释放的抑制
研究人员检测了化合物对感染和未感染巨噬细胞分泌关键细胞因子的影响。结果显示，化合物1和5具有显著的免疫调节活性。它们能强烈抑制被感染巨噬细胞释放促炎细胞因子IL-1β和IL-18，以及抗炎/免疫抑制细胞因子IL-10。这种既能抑制寄生虫生存所需的免疫抑制微环境，又能防止过度炎症损伤的双重调控作用，为这些化合物的治疗价值增添了重要砝码。
2.5. 分子建模
2.5.1. 先导查耳酮与TR的对接
计算机对接分析预测，四种先导查耳酮与TR的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）结合口袋具有最高的结合亲和力。其中，化合物2和1的预测结合能最强，甚至超过了天然辅酶FAD本身。此外，这些化合物在TR的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）、泛醌（UQ5）和锥虫硫酮（GCG）结合位点也有一定的结合潜力。
2.5.2. 先导查耳酮与其他相关FAD/NAD(P)H依赖性脱氢酶的对接
对接研究还扩展到与TR结构相似的其他寄生虫FAD/NAD(P)H依赖性脱氢酶（DLD、NDH2、deCoAR）。结果显示，先导化合物对DLD和NDH2的FAD口袋也具有较好的预测亲和力，但总体上，对TR-FAD口袋的亲和力最强，提示TR可能是优先作用靶点。
2.6. 婴儿利什曼原虫TR和嗜热梭菌NDH2的表达、纯化及活性检测
2.6.1. 婴儿利什曼原虫TR和嗜热梭菌NDH2的表达和纯化
研究人员成功克隆、表达并纯化了具有活性的重组婴儿利什曼原虫TR和嗜热梭菌NDH2，为后续酶学实验提供了材料。
2.6.2. 在先导查耳酮存在下的活性检测
体外酶活实验结果显示，在100微摩尔的高浓度下，先导化合物对纯化的TR和NDH2酶的直接影响较为温和。化合物1和2对TR表现出中等程度的抑制（残留活性分别为86.9%和91.1%）。有意思的是，化合物5反而激活了TR的活性（残留活性155.9%）。对NDH2，化合物2显示了中等抑制（77.2%残留活性），而化合物5仍表现出轻微的激活作用。这些结果表明，直接的、高效的酶抑制可能不是这些化合物主要的、唯一的抗寄生虫机制。
在讨论部分，研究人员对上述发现进行了综合阐述。他们总结出化合物1是系列中最有前景的候选分子，因其对多种利什曼原虫的无鞭毛体均显示出强效活性，具备出色的选择性，并能有效调节宿主免疫反应。结构-活性关系分析明确了A环2,4-二取代模式与B环疏水/电负性基团（如2,4-二氯苯基、4-氟苯基）组合的重要性。虽然计算机对接强烈提示TR的FAD口袋是优先结合位点，但体外酶活实验并未观察到强烈的直接抑制作用，反而出现了激活现象。这提示，这些查耳酮的作用机制可能不是通过高选择性抑制某个单一靶点，而是通过同时、部分地干扰寄生虫氧化还原代谢网络中的多个关键酶（如TR、NDH2、DLD等），从而破坏其精密的氧化还原稳态，最终导致寄生虫死亡。此外，它们对宿主巨噬细胞细胞因子网络的调控作用，也可能协同增强了寄生虫的清除。
结论，这项研究通过系统的化学、生物学和计算生物学手段，成功鉴定出多个具有强效、高选择性抗利什曼活性的查耳酮类先导化合物。化合物1、2、5、12，特别是1，展现出了成为抗利什曼病候选药物的巨大潜力。研究不仅揭示了这类化合物的基本构效关系，也为其可能的作用机制——即通过扰乱寄生虫的氧化还原稳态而非强效抑制单一靶点来发挥作用——提供了重要证据。这项工作为开发新型、双功能（兼具杀虫和免疫调节）的抗利什曼病药物奠定了坚实的基础，是向解决这一被忽视热带疾病治疗困境迈出的重要一步。未来研究将聚焦于这些先导化合物的体内药效、药代动力学性质和安全性评价，以推动其向临床应用发展。
