《Bioprinting》：BIOPRINTED HETEROGENOUS MULTISTRUCTURED BIOMATERIAL WITH LOCALIZED FUNCTIONALIZATION FOR THE REPAIR OF COMPLEX TISSUE
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本研究利用双头挤出式3D打印机，成功制备了模仿牙体结构的异质生物材料。外层为丝蛋白-陶瓷纳米复合材料壳，内层为丝蛋白泡沫软核，两者结合实现力学性能与生物功能的协同优化。实验证实该材料具有良好细胞相容性，且通过功能化处理可增强抗菌性能，为个性化骨-软骨复合组织工程提供了新策略。
克莱尔·德·拉蒂格（Claire de Lartigue）| 萨宾·库赫勒-博普（Sabine Kuchler-Bopp）| 阿琳·埃沙拉尔（Aline Echalard）| 纳伊玛·艾哈迈德·奥马尔（Na?ma Ahmed Omar）| 尤里·阿恩茨（Youri Arntz）| 文森特·菲茨帕特里克（Vincent Fitzpatrick）| 弗洛朗·梅耶（Florent Meyer）| 克里斯托夫·埃格尔斯（Christophe Egles）
鲁昂诺曼底大学（Univ Rouen Normandie）、鲁昂诺曼底INSA（INSA Rouen Normandie）、法国国家科学研究中心（CNRS）、诺曼底大学（Normandie Univ）、生物聚合物与表面研究组（Polymères Biopolymères Surfaces, PBS）UMR 6270，法国埃夫鲁（évreux）圣日耳曼街55号，邮编27000
摘要
在开发生物材料时，应考虑人体细胞排列的固有复杂性和组织的多样性。多头打印技术的出现为制造用于修复或替换人体部位的异质支架提供了可能性。例如，增材制造可以用来生产由软硬层组成的异质材料，模仿牙齿的结构，正如本案例研究中所展示的那样。目前，传统的牙齿替代材料难以准确复制牙齿的结构，而3D打印技术能够更好地模拟牙齿结构，从而促进细胞重新定植并帮助组织修复。
我们使用自制的双头挤出3D打印机打印了两种不同的丝蛋白墨水。第一种墨水与陶瓷微粒结合，用于制造外壳；第二种墨水则形成类似泡沫的支架，构成支架的柔软核心，重现了牙齿的核壳结构。这两种材料均表现出良好的生物相容性和生物活性，能够与成纤维细胞及牙髓干细胞共存，并促进这些细胞在支架内的增殖。此外，我们还成功地将抗菌剂添加到泡沫材料中。
本研究表明，多头3D打印机可用于制造具有异质结构的复杂组织——在本例中，是一种由非细胞化外壳和含有牙髓干细胞的泡沫核心组成的结构。这种方法为开发针对患者的仿生植入物提供了新途径，从而避免了完全替换组织的需求。
引言
人体由有序排列的细胞构成，这些细胞形成了具有特定功能的组织。这些结构的复杂性不仅与参与组织功能的各种细胞类型有关，还体现在蛋白质组装的多样性上，包括细胞外基质的组成和信号传导机制[1]。尽管存在这种复杂性，但目前大多数用于组织再生或修复的策略仍依赖于具有简单均匀性的同质材料[2]。牙齿是一个典型的例子：它结合了两种非细胞化的硬组织（牙釉质和牙本质）以及一种中央的结缔组织（牙髓）。这两种非细胞化硬组织在受伤后的修复能力各不相同：牙釉质位于外部，直接接触口腔环境，由于牙釉质形成细胞在牙齿萌出过程中消失，因此不具备自我修复能力；而牙本质位于内部，受到牙釉质的保护，其自我修复能力主要依赖于覆盖其内部的牙本质生成细胞层及牙髓中的干细胞。牙髓是牙齿内部的结缔组织，具有高度的血管化和神经支配特性，蕴含了所有的再生潜能。由于牙髓在牙本质的生成和矿化过程中起着关键作用，这两种组织通常被统称为“牙本质-牙髓复合体”。目前，对于仅涉及牙釉质或牙本质的损伤，已有许多材料可用于恢复牙齿功能。然而，一旦牙髓的再生能力受损并开始发生组织坏死，目前尚无可行的方法来再生牙髓[3]。现有的解决方案（如水凝胶或多孔硬支架[4]、[5]）主要集中在根管内的牙髓再生上，因为没有材料能够同时满足重建牙齿复杂结构、保证机械强度以及促进细胞生长的要求。因此，亟需开发新一代生物材料，以更接近生物实际状况的方式引导组织再生过程，并改善植入后的恢复效果。
增材制造（也称为3D打印）是一种 promising 的技术，它允许使用陶瓷、聚合物、金属或个性化墨水等材料逐层制造物体。这种多样化的墨水选择使研究人员能够根据复杂支架的需求和所需性能来定制材料[6]。通过多头打印机，可以组合不同类型的墨水，从而实现与天然组织相似的异质结构。该技术不仅能够控制外部几何形状，还能调节内部结构，进而制造出完全符合患者个体特征的植入物[7]。
丝素纤维蛋白（Silk Fibroin, SF）是一种从蚕茧中提取的天然聚合物，具有优异的生物相容性[8]、缓慢的生物降解性[9]、易于化学改性[10]以及可调的机械性能[11]，适用于组织工程领域以及FDA批准的医疗设备[12]、[13]。丝素纤维蛋白可与多种其他材料结合，形成多种类型的复合材料。通过溶解丝素纤维蛋白后，还可将其转化为泡沫、水凝胶、3D打印物体或静电纺丝纤维等多种形式[14]、[15]。不同的加工方法会影响支架的结构（如孔径、密度等）和机械性能（如强度、杨氏模量等）。此外，通过调整加工参数，可以优化最终支架的性能。丝素纤维蛋白还与多种分子或物质（如纳米颗粒[16]）结合，赋予其新的功能，如药物输送或抗菌特性。由于其多功能性和可调性，丝素纤维蛋白成为研究组织工程支架中异质性应用的理想候选材料。
本研究旨在开发一种模拟牙本质-牙髓复合体的异质材料。该材料由一层3D打印的硬质外壳（由丝素-陶瓷纳米复合材料制成）和一层柔软的泡沫核心（由丝素泡沫制成）组成，旨在促进牙髓细胞的再生[17]。我们分别研究了这两种材料的结构、机械性能、生物特性和生物功能性，随后将它们结合成一种异质结构的生物材料。
技术细节
丝素制备
采用Rockwood等人[14]描述的方法提取丝素[16]：将5克家蚕（Bombyx mori）的茧放入2升0.02 M碳酸钠（Sigma-Aldrich, S7795）溶液中煮沸10分钟或60分钟。洗涤并干燥后，将丝素纤维溶解在9.3 M溴化锂（Sigma-Aldrich, 213225）溶液中，得到分子量在171至460 kDa之间的丝素纤维蛋白溶液。
结构
丝素纤维蛋白陶瓷外壳由丝素纤维蛋白溶液、BCP粉末（筛分以均匀颗粒大小）和水混合而成，随后使用自制3D打印机打印并干燥。丝素纤维蛋白泡沫核心的制备过程包括将丝素纤维蛋白溶液、甘油和水混合后冷冻并冻干，形成泡沫。在本研究中，这些泡沫直接被嵌入丝素纤维蛋白陶瓷外壳中，形成异质结构的生物材料（图1.A）。
讨论
本研究聚焦于利用3D打印技术开发和制造由丝素纤维蛋白泡沫核心和丝素纤维蛋白/陶瓷外壳组成的复杂异质生物材料。鉴于其在组织工程领域的应用前景，确定这些支架的机械性能并验证其生物相容性至关重要。
多头3D打印机的出现极大地扩展了3D打印的应用范围，增加了可使用的墨水种类。
结论
组织工程策略在修复人体组织方面备受关注，其中重现组织的固有异质性是实现有效愈合的关键。本研究开发了新型异质支架，由陶瓷硬壳和柔软的泡沫核心组成。丝素纤维蛋白作为一种可生物降解且生物相容的天然聚合物，被用于制备不同的墨水成分。我们的研究表明，这种新型支架的结构……
作者贡献声明
尤里·阿恩茨（Youri Arntz）： 资源提供。
弗洛朗·梅耶（Florent Meyer）： 文章撰写、审阅与编辑。文森特·菲茨帕特里克（Vincent Fitzpatrick）： 文章撰写、审阅与编辑、概念构思。克里斯托夫·埃格尔斯（Christophe Egles）： 文章撰写、审阅与编辑、指导工作、资源协调、资金申请、概念构思。萨宾·库赫勒-博普（Sabine Kuchler-Bopp）： 初稿撰写、资源准备、方法设计、实验实施、数据分析。克莱尔·德·拉蒂格（Claire de Lartigue）： 文章撰写、审阅与编辑、初稿撰写、方法设计、实验实施、数据分析、概念构思。知情同意声明
不适用。
利益冲突声明
作者声明没有可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
资金支持
本研究得到了诺曼底地区（Région Normandie）的博士奖学金、RIN计划、埃夫鲁-诺曼底门户（Evreux Portes de Normandie）以及欧盟FEDER基金的资助。
致谢
作者感谢Clémence Demangel（法国CRITT Matériaux innovation）提供陶瓷粉末，感谢Silvia Jarchow和Ulrike Junge（德国VOCO GmbH）提供VOCO树脂。同时感谢Chloé Eudier进行的微生物实验，以及Sandrine Morin-Grognet（法国鲁昂诺曼底大学PBS Biommat）提供的宝贵建议。Christophe Egles和Claire de Lartigue还感谢诺曼底地区RIN计划、埃夫鲁-诺曼底门户以及欧盟FEDER的支持。
