通过改良Azotobacter chroococcum菌株，有望在中等肥力土壤条件下替代合成氮肥，并减少氮污染物的排放

《Bioresource Technology》：Engineering of Azotobacter chroococcum enables potential replacement of synthetic nitrogen fertilizer and mitigation of nitrogen pollutants release under medium-fertility field conditions

研究通过删除Azotobacter chroococcum的nifL基因中央区域构建突变株A4，该菌株在四年连续传代中保持高效氨素养种能力，转录组学和蛋白质组学分析显示NifA调控的氮固定相关基因及蛋白显著上调。田间试验表明A4可替代合成氮肥，减少氮污染物释放87.4%，同时促进根际微生物氮固定功能且无生态风险。

　　

田萍|王俊峰|王道远|荀玉典|史晓辉|陈明珠|梁云英|杨美婷|李全胜

环境与气候学院，广东省环境污染与健康重点实验室，济南大学，广州510632，中国

摘要

长期以来，人们提出通过基因工程改造能够增强铵盐排泄能力的自由生活固氮菌作为替代哈伯-博施法合成化学氮肥的生物肥料。删除基因已被广泛用于培育具有增强NH₄⁺排泄能力的固氮菌株。然而，基因突变对固氮菌株中基因和蛋白质全局表达的影响，以及其在田间条件下的实际环境效应，尚未得到充分了解。我们通过删除基因的中心区域，创建了一种Azotobacter突变体（A4），且未引入任何额外的启动子或其他遗传修饰。A4表现出优异的铵盐排泄能力，并在连续培养四年期间保持了表型稳定性。转录组学和蛋白质组学分析显示，与野生型相比，A4中NifA激活的基因及其相应的固氮蛋白显著上调。高水平的固氮能力表明，A4有望在中等肥力土壤条件下替代化学氮肥，同时保持蔬菜作物的正常产量。值得注意的是，与常规施肥相比，使用A4可减少87.4%的氮污染物排放。接种A4显著增强了根际微生物群落的固氮相关功能，且未引入潜在的生态风险。这项工作为可持续农业提供了一种稳定且有效的策略。

引言

氮的可用性是作物生产力的主要限制因素，现代农业严重依赖化学氮肥（FAO，2025年）。然而，通过哈伯-博施法生产这些肥料对环境造成了巨大负担，占天然气消耗量的3-5%，全球二氧化碳排放量的1-3%，以及大约60%的人为N₂O排放量（Syakila & Kroeze，2011年）。此外，这些肥料在农业应用中的高效率低下（损失率为50-70%），导致了严重的环境后果（Ribeiro & Santos，2025年）。这些问题包括活性氮物种（N₂O、NO、NH₃）的释放、富营养化、地下水污染和土壤退化，共同威胁着长期生态系统稳定性（Martínez-Dalmau等人，2021年）。人们探索了更多可持续的氮肥替代方案，包括通过基因工程赋予植物生物固氮（BNF）能力、将豆科植物-根瘤菌共生关系转移到谷物中，以及改造天然固氮菌以释放更多固定的氮（Bueno Batista & Dixon，2019年）。在这些方法中，改造土壤中的固氮菌可能是一种能够在短期内产生可测量效果的实用方法。

尽管自由生活固氮菌在土壤中普遍存在，但固定氮或外部供应的氮的存在会强烈抑制它们的固氮酶活性（Darnajoux等人，2022年）。因此，它们的BNF能力不仅无法满足集约化农业系统的需求，还因传统施肥方式而进一步减弱（Bahulikar等人，2021年）。因此，通过基因工程增强自由生活固氮菌的铵盐（NH₄⁺）排泄能力代表了一种有前景的生态策略（Aasfar等人，2021年）。已经开发了许多策略来培育具有增强NH₄⁺排泄能力的固氮菌株（Barney和Dietz，2024年；Gao等人，2025年；Yang等人，2025年；Zhou等人，2025年）。在这些方法中，删除Azotobacter中的基因可显著增强固氮和NH₄⁺排泄能力。这可能归因于NifA在固氮蛋白细菌中启动固氮基因转录中的核心作用，而这一过程通常受到NifL通过直接蛋白质-蛋白质相互作用的抑制（Boyer等人，2023年）。BNF依赖于一个复杂的酶网络，该网络提供还原力、ATP衍生的能量和金属辅因子组装所需的生物合成机制，以及适合氧敏感酶的环境（Dixon和Kahn，2004年；Sun等人，2021年）。NifL基因失活后，突变菌株中参与这些过程的基因和蛋白质的表达可能会发生变化。虽然已经设计了多种突变体来促进NH₄⁺排泄（Filser等人，1983年；Mus等人，2022年），但大多数研究主要集中在固氮酶结构基因（< />）、固氮酶活性以及与< />相邻的上游< />基因的表达上（Mus等人，2022年）。迄今为止，只有AZBB163突变体对其所有与BNF相关的基因进行了转录分析（Barney等人，2017年），且尚未有任何突变体在蛋白质组水平上进行过与BNF相关蛋白质的特征分析。突变对BNF相关基因和蛋白质全局表达的影响仍不完全清楚。

此外，关于在非无菌盆栽条件下铵盐排泄突变体对植物生长的有益影响的研究案例很少（Fox等人，2016年；Van Dommelen等人，2009年）。目前关于突变的研究缺乏其在田间条件下对作物氮营养和减少氮污染物方面的确凿证据（Bueno Batista & Dixon，2019年）。据报道，突变体Klebsiella variicola 137–1036在田间显著提高了玉米产量，但其替代氮肥的效果尚未得到充分研究（Wen等人，2021年）。唯一在田间试验中应用的突变体A. chroococcum HKD15替代了约15 mg kg^?1的尿素衍生氮（Bageshwar等人，2017年）。这表明，使用高效固氮突变体替代化学氮肥的实际环境效应尚未得到专门研究。

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基因的结构包括特征明确的< />

末端PAS结构域和C末端GHKL结构域，以及一个功能不明确的中央连接区域，在本研究中称为中央区域（Dixon & Kahn，2004年）。几乎所有报道的突变体都删除了编码区域的大部分、< />末端PAS结构域或C末端GHKL结构域（Barney等人，2015年；Mus等人，2022年）。在这里，我们仅删除了A. chroococcum基因的中央区域来创建突变体。未向突变体引入任何额外的启动子或其他遗传修饰。该突变体表现出优异的铵盐排泄能力，并在连续培养四年期间在恒定常规培养条件下保持了这一表型。我们利用野生型和突变体之间的比较转录组学和蛋白质组学分析，阐明了NifL失活后氮代谢的分子机制。随后，在多次田间试验中证实了该突变体的稳定固氮能力，它在中等肥力土壤条件下替代了化学合成氮肥。应用这种生物肥料显著减少了氮污染物的排放。

菌株构建

为了生成一系列部分基因缺失的突变体，包括Z1（122–434个氨基酸）、A2（3–136个氨基酸）、A3（119–261个氨基酸）和A4（250–387个氨基酸），基于野生型固氮菌株A. chroococcum（Ac）进行了基因克隆和重组质粒构建（见补充材料）。菌株在28°C下培养于改良的Burk无氮培养基或SOC培养基中（Wang等人，2020年）。使用聚合酶链反应（PCR）、重叠延伸PCR、双酶切割和连接技术进行操作

基因中央区域的缺失足以使Azotobacter chroococcum高效排泄铵盐

我们构建了四种携带基因不同片段缺失的Azotobacter chroococcum CICC 22663（Ac）突变体，分别命名为A4、A2、A3和Z1（图1A）。突变体A4已保存在广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC 63557。除了突变体Z1外，其他突变体仅删除了特定的序列，未引入外源基因或其他突变。在这些突变体中，A2和A3形成了可见的

结论

总体而言，我们通过仅删除基因的中央区域来构建了一种新型的铵盐分泌Azotobacter菌株，未引入任何额外的启动子或其他遗传修饰。多组学分析显示，NifA激活的基因及其对应的蛋白质表达水平较高，这是其铵盐排泄表型的基础。该菌株在蔬菜田间试验中显示出替代化学氮肥的潜力，同时保持了正常

CRediT作者贡献声明

田萍：撰写——原始草稿、可视化、验证、调查、正式分析。王俊峰：撰写——审阅与编辑、验证。王道远：撰写——审阅与编辑。荀玉典：调查。史晓辉：调查。陈明珠：调查。梁云英：调查。杨美婷：调查。李全胜：撰写——审阅与编辑、监督、资源获取、数据管理、概念化。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：李全胜表示获得了中国国家自然科学基金的支持。李全胜持有济南大学的专利申请。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（41977265）和济南大学项目（40120175、40122086、40124103）的支持。我们感谢Ray Dixon对本文中关于微生物固氮和逻辑框架的深刻评论。