通过蛋白质自组装和生物矿化技术构建双酶杂化纳米花，以实现d-塔格糖的高效生物合成

《Bioresource Technology》：Construction of dual-enzyme hybrid nanoflowers by protein self-assembly and biomineralization for efficient biosynthesis of d-tagatose

本研究通过ST/SC介导的自组装与生物矿化构建了β-Gal-SC@ST-LFAI酶-无机杂交纳米花，显著提升催化活性与稳定性，并验证其在d-塔格托糖合成中的应用效果。

　　

Jing Zhang|Liqiang Yan|Huihui Su|Xiaoyang Ou|Tao Xiong|Mingyong Xie|Fei Peng

南昌大学食品科学与技术学院，中国江西省南昌市南京东路235号，330047

摘要

酶-无机杂化纳米花（HNFs）由于其简单的制备工艺和通常增强的催化性能，成为有前景的固定化平台。本文通过ST/SC介导的自组装和生物矿化作用，共固定β-半乳糖苷酶（β-Gal）和β-阿拉伯糖异构酶（LFAI），开发出一种用于d-塔加托糖生物合成的高效稳定型杂化纳米花（β-Gal-SC@ST-LFAI）。首先，研究了关键固定化条件对β-Gal-SC@ST-LFAI制备的影响。在最佳条件下，β-Gal-SC@ST-LFAI表现出比传统β-Gal@LFAI更高的催化活性和活性恢复率。与自由酶体系相比，β-Gal-SC@ST-LFAI具有更好的热稳定性、pH耐受性和有机溶剂抗性。通过SEM、CLSM、DLS、FTIR、CD和BET技术进一步表征了β-Gal-SC@ST-LFAI的结构。所得HNFs呈现出典型的花朵状结构，平均直径为1.83微米，比表面积为18.57平方米/克。CD光谱显示，与自由级联酶相比，β-Gal-SC@ST-LFAI中的α-螺旋含量减少，β-折叠含量增加。此外，β-Gal-SC@ST-LFAI的Km值低于自由级联酶，表明其底物亲和力增强。HNFs还表现出比自由酶更好的储存稳定性和操作稳定性，在七次重复使用后仍保持超过77.99%的级联催化活性。最后，β-Gal-SC@ST-LFAI能够以37.22%的产率催化d-半乳糖转化为d-塔加托糖。本研究为构建具有高催化效率和过程稳定性的多酶HNFs提供了实用策略。

引言

多酶级联催化能够直接将低成本、易获得的底物转化为高附加值产品，从而减少能源消耗和废物排放，同时提高产品产量（Yu等人，2021年）。自由酶在高温、极端pH值和有机试剂等苛刻条件下容易失活（Robescu和Bavaro，2025年）。通过共价键合、物理吸附、包封和交联等多酶固定化方法显著提高了级联酶的稳定性和可重复使用性（Hu等人，2025年）。然而，传统的共固定化技术涉及复杂的制备过程，存在明显的底物转移限制，并导致固定化酶的催化活性显著下降，严重限制了它们的工业应用（Sun等人，2014年）。

酶-无机杂化纳米花（HNFs）通常是通过酶和无机成分的共沉淀生成的，形成具有高比表面积和多孔结构的花朵状三维结构（Chen等人，2023年）。由于其易于制备、增强的催化性能和改善的操作稳定性，HNFs已成为酶固定化的有吸引力的技术（Aydemir等人，2024年）。例如，Ren等人通过脂酶和Cu²⁺的自组装制备了脂酶@MNFs，所得纳米花表现出比自由脂酶更高的活性以及更好的热稳定性和pH稳定性（Ren等人，2019年）。Rai等人构建了MnNF@L-AI纳米花，其d-半乳糖转化率达到50%。这种生物矿化策略也适用于多酶系统的固定化（Rai等人，2018年）。Aydemir等人报告称，通过Cu²⁺共沉淀淀粉酶、脂酶和蛋白酶制备的TrpE@iHNFs表现出比相应自由酶混合物更高的催化活性（Aydemir等人，2020年）。Li等人证明，通过调节葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶在HNFs中的相对含量，可以形成空间有序的Gox@HRP HNFs，其活性比自由级联酶高2.1倍（Li等人，2014年）。合理调节HNFs内酶的空间分布可能是多酶催化性能的关键决定因素。

SpyTag/SpyCatcher（ST/SC）源自化脓性链球菌中的CnaB2结构域，能够在生理条件下通过形成不可逆的异肽键实现快速自发的蛋白质共轭（Cai等人，2025年）。由于其高特异性和与温和反应条件的兼容性，ST/SC已被广泛用于构建具有改进催化性能的固定化酶系统。例如，Lin等人报告称，通过xylanase–SpyTag–lichenase（XSTL）和SC–ELP@SiO₂之间的共轭组装得到的XSTL/SC-ELP@SiO₂表现出比自由酶更高的热稳定性和可重复使用性（Lin等人，2021年）。Wang等人通过ST/SC介导的自组装将SC-LeuDH和GDH-ST共固定在ZIF-8中，得到LeuDH–GDH@ZIF-8，其活性提高了1.38倍，pH和热稳定性也得到改善（Wang等人，2023年）。类似地，Ma等人利用ST/SC介导的自组装制备了三种纤维素酶的交联酶聚集体（C-CLEAs），显著提高了稳定性和可回收性（Ma等人，2025a，Ma等人，2025b）。迄今为止，ST/SC已成为构建稳定固定化生物催化剂的多功能有效平台。然而，据我们所知，ST/SC尚未用于构建酶-无机HNFs。

d-塔加托糖是一种天然存在的稀有功能性糖，具有多种健康益处，包括减缓餐后血糖反应（Sokolowska等人，2022年）、调节肠道微生物群（Liang等人，2019年）和抗龋活性（Mayumi等人，2021年）。一种经济高效的d-塔加托糖生产方法是利用β-半乳糖苷酶（β-Gal）和β-阿拉伯糖异构酶（LFAI）进行级联转化（Liu等人，2022年）。然而，这种方法的应用受到自由酶稳定性有限和级联效率低下的限制（Rai等人，2021年）。在本研究中，我们通过结合ST/SC介导的自组装和酶-无机生物矿化作用，构建了稳定的级联生物催化剂β-Gal-SC@ST-LFAI。首先，研究了关键固定化因素对ST/SC自发反应和酶-无机生物矿化作用下β-Gal-SC@ST-LFAI制备的影响。然后使用扫描电子显微镜（SEM）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、Brunauer–Emmett–Teller（BET）技术和圆二色光谱（CD）系统地对优化的β-Gal-SC@ST-LFAI进行了表征。最后，评估了β-Gal-SC@ST-LFAI的酶学性质及其d-塔加托糖合成催化能力。

实验部分

菌株和试剂

重组大肠杆菌菌株E. coli BL21(DE3)-pET22b-β-Gal、E. coli BL21(DE3)-pET28ɑ-LFAI、E. coli BL21(DE3)-pET22b-β-Gal-SC和E. coli BL21(DE3)-pET28ɑ-ST-LFAI由我们的实验室构建。对于融合构建体，酶和ST/SC模块使用(GGGGS)₂连接器连接。d-塔加托糖（纯度99%）和d-半乳糖（纯度98%）购自上海Aladdin生化技术有限公司（中国上海）。所有其他试剂均为分析级。

关键条件对β-Gal-SC@ST-LFAI制备的影响

β-Gal和LFAI基因在E. coli BL21(DE3)中以可溶形式表达（见补充材料）。β-Gal-SC和ST-LFAI能够自发自组装形成蛋白质复合物β-Gal-SC-ST-LFAI（见补充材料）。在此过程中，蛋白质融合并未影响ST/SC模块的组装能力。接下来我们在不同条件下制备了β-Gal-SC和ST-LFAI的HNFs（图1）。金属离子参与了蛋白质-无机HNFs的形成。

结论

本研究通过将ST/SC自组装系统与生物矿化作用相结合，构建了一种具有高活性和优异稳定性的双酶HNF β-Gal-SC@ST-LFAI。与传统的双酶杂化纳米花β-Gal@LFAI相比，β-Gal-SC@ST-LFAI表现出更高的催化活性、包封产率和活性恢复率。结构和酶动力学分析表明，该杂化纳米花发生了二级结构重排，其Km值更低。

CRediT作者贡献声明

Jing Zhang：撰写——原始草稿、可视化、方法学、实验研究。Liqiang Yan：概念设计。Huihui Su：实验研究。Xiaoyang Ou：实验研究。Tao Xiong：实验指导。Mingyong Xie：项目管理。Fei Peng：撰写——审稿与编辑、实验指导、资源管理、项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。