Neurospora intermedia用于单细胞蛋白质生产：通过培养基优化及常压和室温等离子体诱变技术实现性能提升

《Bioresource Technology》：Neurospora intermedia for single-cell protein production: Enhancement by medium optimization and atmospheric and room temperature plasma mutagenesis

高效蛋白生产真菌N. intermedia T154的筛选与发酵优化及其在肉 analogs中的应用。

　　

赵海峰|孙世创|金梦茹|李俊龙|李明霞|王莉|张伟|王梦杰|朱如刚|李铁静|曹家璐|康定荣

辽宁大学轻工业学院，中国沈阳110036

摘要

Neurospora intermedia能够高效地将低成本底物转化为单细胞蛋白质；然而，实现高密度培养的系统策略仍知之甚少。在这项研究中，我们通过大气压和室温等离子体（ARTP）诱变技术，从Neurospora intermedia FF171菌株中培育出了一个高蛋白产量的突变体T154，该突变体具有稳定的遗传特性。使用糖蜜作为碳源，并采用Box-Behnken设计优化培养基后，细胞密度达到了约60克/升干重，蛋白质产量从18.0克/升提高到了28.9克/升。值得注意的是，经过120秒ARTP处理后获得的T154菌株最终蛋白质产量达到了35.1克/升，比单独优化培养基提高了22%。此外，用T154生物量制成的肉类替代品表现出较低的水分损失（35%）和更好的质地特性（例如：咀嚼性：290.5克）。总体而言，这项研究为Neurospora intermedia的高密度培养建立了一种有效策略，并凸显了其作为可持续替代蛋白质来源的巨大潜力。

引言

随着全球人口的快速增长和人们对可持续性的日益关注，传统的动物性和植物性蛋白质生产面临着巨大的挑战，包括高资源需求和显著的环境影响（Zhang等人，2022年）。因此，单细胞蛋白质（SCP）作为一种可持续的替代品受到了广泛关注（He等人，2024年）。丝状真菌尤其具有潜力，因为它们能够快速积累生物量、含有高蛋白，并能利用多种农业副产品（Karimi等人，2019年）。Neurospora intermedia自公元前3000年起就被用于印度尼西亚的肿瘤生产中，这一应用充分展示了其潜力（Maini Rekdal等人，2024年）。此外，使用N. intermedia进行固态发酵可以提升食品残渣的营养价值，增加蛋白质含量并富含必需氨基酸、矿物质和维生素D₂（Gmoser等人，2020年）。

高密度发酵是提高体积生产力的关键策略。然而，这一过程常常受到细胞生长速率降低、抑制性代谢物积累以及菌株稳定性下降的限制，这些因素共同构成了主要瓶颈（de Assis等人，2022年）。先前的研究表明，优化培养基成分可以显著提高生物量和代谢产物的产量（Singh等人，2017年）。例如，Akyuz等人（2024年）通过Plackett–Burman设计和响应面方法优化了KH₂PO₄、Ca(NO₃)₂和pH值，将浮萍的蛋白质含量从39.8%提高到了51.1%。类似地，对Janthinobacterium的研究表明，优化关键培养基因素（包括碳源、表面活性剂和pH值）可使蛋白酶活性提高6.25倍，并引发显著的代谢重组（Kim等人，2020年）。尽管这些研究涉及多种生物系统，但针对N. intermedia的高密度发酵进行培养基优化的效果仍大多未被探索。因此，需要对N. intermedia进行系统的培养基优化研究，以阐明其在高密度蛋白质生产方面的潜力。

诱变是一种强大的微生物育种工具，可用于提升菌株性能。在各种技术中，ARTP诱变因其在常温高能等离子体处理下能诱导稳定的基因突变而受到越来越多的关注（Ji等人，2025年）。在二十二碳六烯酸的生产中，ARTP诱变与化学筛选相结合成功培育出了高产突变体6–23，其产品浓度达到了41.4克/升，从而有效降低了生产成本（Zeng等人，2021年）。同样，ARTP也被应用于Actinoplanes JN537菌株，其中突变体M37的阿卡波糖产量比野生型菌株提高了62.5%（Ren等人，2017年）。然而，尽管ARTP诱变在细菌和微藻中的效果已被证实，但在丝状真菌（特别是N. intermedia中的应用仍较为有限。迄今为止，其在提高N. intermedia的蛋白质含量和功能性特性方面的潜力尚未得到系统研究。

本研究旨在提升N. intermedia的蛋白质产量和功能性特性，以用于替代蛋白质应用。我们结合了培养基优化和ARTP诱变技术来提高蛋白质产量和整体功能性。通过使用糖蜜作为碳源，本研究还展示了农业副产品的价值转化。这一策略包括优化高密度发酵条件，随后进行诱变和定向筛选，为培育适用于肉类替代品和功能性食品应用的遗传改良菌株提供了框架。

菌株与培养

野生型N. intermedia菌株FF171最初是从普洱茶中分离和鉴定出来的。该菌株已存入中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC编号40496）。在优化培养后，使用该菌株进行了ARTP诱变。为了制备孢子，该菌株在酵母提取物培养基中于35℃和220转/分钟条件下培养48小时，然后通过1000目纱布过滤器过滤获得孢子。

碳源

为了优化蛋白质产量，N. intermedia FF171在六种不同的碳源上进行了培养。如图1a所示，糖蜜产生的蛋白质浓度最高（15.8克/升），其次是玉米淀粉（14.5克/升）和果糖（14.1克/升）。尽管这三种碳源之间的蛋白质产量差异没有统计学意义（p > 0.05），但由于糖蜜作为糖精炼副产品的经济和环境优势，我们选择了它作为最佳碳源。

结论

本研究表明，N. intermedia FF171是一个稳健且有前景的平台，适用于高密度培养下的可持续单细胞蛋白质生产。通过结合培养基优化和ARTP诱变，我们获得了遗传稳定的突变体T154，其蛋白质产量显著提高。5升生物反应器培养的最大干重为87.1克/升，蛋白质产量为37.7克/升。来自T154的蛋白质也表现出良好的性能。

未引用参考文献

Banks等人，2024年；Coelho等人，2020年。

CRediT作者贡献声明

赵海峰：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、概念构建。孙世创：方法学设计、实验研究、概念构建。金梦茹：数据可视化、软件应用。李俊龙：数据可视化、实验研究。李明霞：数据可视化、实验研究。王莉：软件应用、实验研究。张伟：撰写、审稿与编辑、方法学设计。王梦杰：数据可视化、软件应用。朱如刚：撰写、审稿与编辑、方法学设计。李铁静：撰写、审稿与

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：作者李俊龙、李明霞、王莉、张伟、曹家璐和康定荣受雇于DeePro Technology（北京）有限公司。其余作者声明本研究在没有任何可能构成利益冲突的商业或财务关系的情况下完成。

致谢

本研究得到了北京市农业农村局（项目编号BMBARA202310）、北京科学技术协会（项目编号BAST202401）以及北京市平谷区高层次人才工作室发展计划的支持。