Miichthys miiuy 中半乳凝集素-2 的鉴定及其抗菌特性研究

《Developmental & Comparative Immunology》：Identification and Antimicrobial Characterization of Galectin-2 in Miichthys miiuy

本研究克隆并表征了石斑鱼Galectin-2（mmiGal-2），分析其结构及进化特征，发现其具有组织特异性表达（肌肉最高，肝脏最低），并验证了重组蛋白在弱酸性环境下（pH6）以0.5 mM IPTG诱导16小时高效表达。体外实验显示mmiGal-2对革兰氏阴性菌（如Vibrio parahaemolyticus、Escherichia coli）有显著抑菌活性，但对革兰氏阳性菌（如Staphylococcus aureus）效果较弱，其表达在LPS刺激下肾脏及细胞中上调。该研究为鱼类Galectin家族研究及水产抗菌剂开发提供新依据。

　　

单思琪|李文欣|潘子月|徐天军|孙悦娜

中国上海海洋大学渔业与生命科学学院鱼类分子免疫学实验室

摘要

半乳糖凝集素-2（Galectin-2）属于半乳糖凝集素家族，作为一种免疫调节分子，在炎症反应、细胞凋亡和免疫稳态维持中发挥着重要作用。在本研究中，我们从一种具有商业价值的海洋硬骨鱼类Miichthys miiuy中鉴定并表征了一种半乳糖凝集素，将其命名为mmiGal-2。选择该物种是因为它容易受到多种水产养殖病原体的感染，因此适合用于研究硬骨鱼类的先天免疫机制。与哺乳动物的半乳糖凝集素不同，mmiGal-2具有与硬骨鱼类抗菌防御相关的结构和功能特征。对其基因序列、结构和进化模式的分析揭示了保守的功能域及其独特的系统发育关系。体外抗菌实验表明，重组蛋白mmiGal-2对细菌生长具有不同的抑制作用：对革兰氏阴性菌（Vibrio parahaemolyticus、Escherichia coli）表现出明显的抑制效果，而对革兰氏阳性菌Staphylococcus aureus的抑制作用较弱。mmiGal-2的表达具有明显的组织特异性，在肌肉和肝脏中的表达水平最高和最低。此外，RT-qPCR分析显示，在Miichthys miiuy受到脂多糖（LPS）免疫刺激后，其表达在肾脏和细胞中随时间增加。通过SDS-PAGE和Western Blot技术，我们确定了生产重组mmiGal-2蛋白的最佳条件：在弱酸性环境（pH 6）下，使用0.5 mM IPTG于30°C诱导16小时。本研究扩展了人们对鱼类半乳糖凝集素家族的认识，并为开发新的水产养殖用抗菌剂提供了新的见解和基础。

引言

半乳糖凝集素是一类能够特异性识别并结合β-半乳糖苷的凝集素（Cooper, D. N., 2002）。它们广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物中，在进化过程中保持保守性，目前已鉴定出至少15种不同的成员（Hirabayashi, J. 和 Kasai, K., 1993）。根据结构差异，半乳糖凝集素可分为三种类型：原型型、串联重复型和嵌合型。原型型半乳糖凝集素包含一个碳水化合物识别域（CRD），例如Galectin-1、-2、-5、-7、-10、-11、-13、-14和-15；串联重复型半乳糖凝集素具有两个通过短连接肽连接的CRD，例如Galectin-4、-6、-8、-9和-12；唯一的嵌合型半乳糖凝集素Galectin-3由一个CRD与一个富含脯氨酸和甘氨酸的域组成（Almkvist, J. 和 Karlsson, A., 2002）。

作为模式识别受体（PRRs），半乳糖凝集素通过结合细胞表面或病原体上的糖缀合物，在免疫识别、细胞凋亡、炎症和病原体清除过程中发挥多种功能（Davicino, R. C. 等, 2011; Liu, F. T. 和 Stowell, S. R., 2023）。功能研究主要集中在Galectin-1、-3、-8和-9上。例如，Galectin-1及其配体是免疫反应的关键调节因子，涉及T细胞稳态和存活、T细胞免疫障碍、炎症和过敏以及宿主-病原体相互作用（Camby, I. 等, 2006）。Galectin-3被认为是一种重要的巨噬细胞和小胶质细胞活性调节剂，在生理和病理生理条件下以上调或下调的方式调节大脑的先天免疫反应和小胶质细胞激活模式（Rahimian, R. 等, 2021）。Galectin-8还通过直接作用于树突状细胞并诱导某些促炎细胞因子的产生，在抵抗细菌和病毒感染中起重要作用（Puri?, E. 等, 2024）。此外，TIM-3/Galectin-9相互作用促进肿瘤免疫逃逸；阻断这一轴可以调节免疫细胞功能并发挥抗肿瘤作用（Zhao, L. 等, 2021）。

近年来，关于Galectin-2抗菌功能的研究取得了初步进展。在哺乳动物中，已证实人类半乳糖凝集素-2通过β-半乳糖苷依赖途径对Helicobacter pylori具有直接的杀菌作用。此外，这种蛋白质可以特异性结合H. pylori表面的含有H型I抗原的脂多糖，并在胃黏膜层附近的弱酸性微环境中（pH 5.5–6.5）使细菌细胞聚集。半乳糖凝集素-2还与半乳糖凝集素-3协同作用，参与建立胃黏膜防御屏障（Sasaki, T. 等, 2020; Sasaki, T. 等, 2024）。在水生动物中，Oreochromis niloticus和Oplegnathus fasciatus中的半乳糖凝集素-2在细菌感染后表达上调。重组蛋白对Streptococcus agalactiae、Aeromonas hydrophila等细菌具有广谱的聚集和生长抑制作用，并可通过增强吞噬细胞功能来调节先天免疫反应（Niu, J. 等, 2019; Niu, J. 等, 2020; Thulasitha, W. S. 等, 2017a）。在鸟类中，樱桃谷鸭（Cherry Valley ducks）中的半乳糖凝集素-2也被证明在抵御E. coli感染时通过调节炎症反应和抗菌活性发挥关键防御作用（Li, T. 等, 2020）。在这里，我们首次从在中国和东亚沿海地区广泛养殖和消费的海洋食用鱼类Miichthys miiuy中克隆了半乳糖凝集素-2基因，系统分析了其结构和进化特征，并表征了其在LPS免疫刺激下的组织表达谱和表达模式。为了阐明M. miiuy半乳糖凝集素-2的分子功能，我们使用原核表达系统生产了该蛋白，并在体外验证了其抗菌特性。对M. miiuy半乳糖凝集素-2基因的功能鉴定旨在丰富鱼类半乳糖凝集素家族的研究数据，并为M. miiuy的疾病控制策略开发提供理论支持。

章节片段

M. miiuy中半乳糖凝集素-2的鉴定

为了定位M. miiuy中的半乳糖凝集素-2基因，我们以大型黄鲷鱼（Larimichthys crocea）的基因组序列作为参考模板。利用本地BLASTn和tBLASTn程序，成功从M. miiuy数据库中检索到了相关的转录组和基因组数据，从而促进了后续研究（Xu, T. 等, 2016）。

生物信息学分析

使用SMART在线网站（https://smart.embl.de/smart/change_mode.cgi）预测了半乳糖凝集素-2的保守域（Letunic

半乳糖凝集素-2的进化和结构分析

mmiGal-2的开放阅读框（ORF）为408个碱基对（bp），编码135个氨基酸（aa）的蛋白质。未添加标签的mmiGal-2多肽的理论分子量为15.36 kDa；当mmiGal-2多肽与6个His标签融合用于重组表达时，标记融合蛋白的理论分子量约为16 kDa，理论等电点（pI）为5.13。使用相关工具未检测到信号肽或跨膜结构域（TMDs）

讨论

现有研究表明，半乳糖凝集素是一类在进化过程中高度保守的模式识别受体，能够直接结合病原体，参与生物体的先天免疫，并通过多种调节机制影响宿主对病原体的反应（Johannes, L. 等, 2018）。尽管半乳糖凝集素基因家族已在多种物种中得到广泛研究，但在鱼类中的研究仍然相对有限。本研究主要关注了mmiGal-2

CRediT作者贡献声明

单思琪：撰写——初稿、方法学、实验设计、数据分析。李文欣：撰写——审稿与编辑、实验设计、数据分析。潘子月：软件应用、数据分析。徐天军：撰写——审稿与编辑、监督。孙悦娜：撰写——审稿与编辑、结果验证、监督。