《Fish & Shellfish Immunology》：Sampling conditions affect immune cell viability and function in the Mediterranean mussel (
Mytilus galloprovincialis)
编辑推荐：
评估地中海贻贝血细胞体外最佳采样条件，通过比较四种采血管溶液（mL15、LiH+ mL15、MAS、FSW）发现MAS能显著提高总血细胞计数（THC），而LiH+ mL15在维持血细胞存活率、膜糖蛋白保留及吞噬活性方面更优。
特蕾西娜·德·伊奥里奥（Teresina De Iorio）、基娅拉·普罗菲科（Chiara Profico）、法布里齐奥·卡波乔尼（Fabrizio Capoccioni）、加布里埃拉·迪·弗朗切斯科（Gabriella Di Francesco）、费德里卡·迪·贾钦托（Federica Di Giacinto）、阿里安娜·马尔蒂尼（Arianna Martini）、马可·马丁诺利（Marco Martinoli）、里卡多·纳波利塔诺（Riccardo Napolitano）、尼科洛·托纳切拉（Nicolò Tonachella）、多米蒂拉·普尔奇尼（Domitilla Pulcini）
农业研究与农业经济分析委员会（CREA）。动物生产与水产养殖研究中心，Via Salaria, 31, 00015, Monterotondo, RM, 意大利
摘要
养殖动物的福利正成为一个具有社会意义的问题。已经开发出多种策略来体外评估养殖动物的福利，包括免疫功能的评估。适当的免疫细胞分离在体外研究细胞功能中起着关键作用。本研究旨在确定最佳采样条件，以促进地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）血细胞的活力和免疫功能。
根据采样所用溶液的不同，贻贝被分为4组：改良的Leibovitz's 15培养基（mL15）、肝素锂+mL15（LiH + mL15）、改良的Alsever溶液（MAS）和过滤海水（FSW）。收集了血淋巴液，并检测了总血细胞计数（THC）、膜糖蛋白保留率、活力和吞噬作用。与其它组相比，MAS组的THC显著更高，而LiH + mL15组的糖蛋白保留率最高。体外培养时间对血细胞活力没有影响，但使用LiH + mL15采样的血细胞活力高于MAS组和FSW组。LiH + mL15组的吞噬能力也更强。
结果表明，MAS适合用于THC的检测；而对于功能研究，建议使用LiH + mL15，因为它能最好地保持血细胞的活力、膜糖蛋白以及吞噬活性和能力。
引言
遵循“同一健康”（One Health）的理念，在生产系统中维持高福利标准有助于降低疾病爆发的风险并促进公共卫生。健康的动物对病原体有更强的抵抗力，从而减少疾病在野生和养殖种群中的传播[1]。近年来，气候变化加剧了环境压力，这可能通过增加动物对疾病的易感性来损害其福利。这些影响在海洋和沿海生态系统中尤为明显，并影响了水产养殖系统的生产力和可持续性，例如双壳类养殖[2]。从2014年到2023年，欧洲地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）的产量减少了30%以上[3]。这一趋势部分可以归因于该物种对海洋热浪的高度敏感性，热浪会影响其生存和代谢[4,5]，以及海洋酸化，酸化会降低贝壳硬度并损害生物矿化过程，最终削弱动物的适应能力[6]。
双壳类动物的福利状况仍很大程度上未得到研究，因为目前还没有确凿的证据证明它们具有感知能力[7]。双壳类动物是滤食性生物，依赖周围环境的质量。因此，贻贝养殖系统的福利要求应确保它们能够获得清洁且未受污染的水，并保持适当的养殖密度[8]。众所周知，良好的养殖实践和适宜的环境条件在整个生产周期内对养殖双壳类动物的福利和产品质量都有积极影响[9]。
在水产养殖中，福利评估基于不同类别的指标。对于鱼类，这些指标包括描述水质、管理和饲养条件的操作指标，以及基于行为的指标[10,11]。更专业的实验室方法依赖于直接的动物指标，侧重于健康状态的生理或生化标志物[10,11]。然而，对双壳类动物的直接福利评估面临特定挑战：在贻贝养殖场，通过视觉检查发现病变或异常行为往往不可行。因此，生物标志物的使用成为评估养殖贝类健康和福利的一种有前景的方法[9],[12],[13],[14]。已经使用了多种生理（如状况指数、暴露耐受性）、行为（如掘洞率）、组织化学（如消化腺中的中性脂质和脂褐素）和化学（如重金属、多氯联苯、多环芳烃）生物标志物来评估Ruditapes philippinarum在受污染和未受污染养殖环境中的福利[9,15]。最近，分子应激生物标志物，如热休克蛋白（HSP）基因表达和丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK、p44/42 MAPK、pJNKs）的磷酸化，也被用于评估海鞘生物污损对M.galloprovincialis的影响[14]。
在贻贝中，对环境和人为刺激的生理反应以及抵御病原体的能力是由循环在血淋巴液中的血细胞（hemocytes）介导的[16]。这些细胞通过一个开放系统循环，为组织和体腔外液体提供营养，并参与免疫防御以及营养物质的运输和贝壳修复机制[17]。因此，贻贝依赖快速的免疫和凝血反应来对抗感染并防止受伤时血淋巴液的流失[18]。然而，在体外处理双壳类动物的血细胞存在技术挑战，因为细胞在生理盐水溶液中容易发生不可逆的聚集[19]。为了防止聚集，使用了多种抗聚集溶液，如改良的Alsever溶液（MAS）[20]和过滤海水（FSW）[21]。然而，研究表明MAS会改变Scapharca broughtonii的酶活性[22]，并降低Pecten maximus的吞噬作用[23]。由于MAS含有柠檬酸钠和EDTA这两种阳离子螯合剂，它们可能会干扰M. galloprovincialis血细胞中依赖钙的功能，如黏附和与吞噬作用相关的活性氧及氮物种的形成[24]。因此，抗凝剂不仅应防止聚集，还应尽可能保持血细胞的形态和功能，接近体内状态。
在这项研究中，使用了与免疫相关的生物标志物（血细胞活力、膜糖蛋白保留率、吞噬活性和吞噬能力）来确定M.galloprovincialis血细胞功能研究的最佳采样条件。选择这些指标是因为它们能可靠地反映动物健康状况，成本相对较低且易于标准化，并且可以通过新兴技术进一步改进。
实验部分
贻贝采集
样本来自意大利第勒尼安海萨博迪亚海岸泻湖的一个贝类养殖场，并在含有人工海水（ASW；Instant Ocean）的循环系统中适应了7天。水参数再现了养殖场的季节性环境条件：温度（24 ± 1°C）、盐度（32 ± 2 psμ）、pH值（8.20 ± 0.1）。每天给动物喂食浮游动物-浮游植物混合物（AF Phyto Mix，Aquaforest）。
结果
各组之间的壳长和壳高没有显著差异（Kruskal-Wallis检验，H = 2.33；p ≥ 0.05）。
讨论
为贻贝开发“基于实验室”的福利指标可以从体外研究血细胞的功能中获得益处，因为血细胞在双壳类动物的免疫防御反应中起着关键作用。免疫标志物可以帮助识别双壳类动物的应激状态。然而，体外处理血细胞较为困难，因为它们容易永久性聚集，从而妨碍进一步的操作和功能分析。因此，本研究评估了不同的采样条件（即
结论
本研究表明，采样条件对双壳类动物的血细胞计数、形态、活力和细胞功能参数有显著影响。MAS被证明是进行准确总血细胞计数（THC）的最可靠方法，而肝素锂与改良的mL15结合使用则最能保持血细胞的活力、膜完整性和吞噬活性。基于这些发现，建议使用MAS进行THC检测，而功能研究应采用肝素锂
伦理批准
根据欧洲和意大利的相关法规（2010年9月22日欧洲议会和理事会关于科学用途动物保护的指令2010/63/EU，以及2014年第26号意大利立法法令），对贻贝的实验使用无需伦理批准。
致谢
本研究由意大利农业、粮食主权和林业部（MASAF）资助，项目名称为OPTIFARM（资助编号N. J87G624000030001）。
