在富含蛋白质的食物热加工过程中，酪氨酸残基会发生不可逆的氧化修饰，生成二酪氨酸，这是一种稳定的交联产物，可作为蛋白质氧化的特异性生物标志物（DiMarco & Giulivi, 2006）。富含酪氨酸的食物（如乳制品、巴氏杀菌牛奶、奶酪）和肉类制品（如香肠、炖肉和烤肉）是二酪氨酸的主要膳食来源（B. Li et al., 2023）。据报道，牛奶中的二酪氨酸含量为0.23-0.26 μg/g蛋白质，而奶粉中的含量为0.9-28.6 μg/g蛋白质（Fenaille et al., 2006; Yang et al., 2017）。结构上，二酪氨酸由两个酪氨酸分子通过碳-碳键连接，使其具有抗蛋白酶和酸水解性，从而能够在体内积累（Xue et al., 2023）。二酪氨酸已被证实与细胞功能障碍和疾病进展有关，主要通过氧化应激途径（Ding et al., 2020; Ding et al., 2023; Ge et al., 2025; B. Li et al., 2019; Lu et al., 2020; Yang et al., 2017）。其对发育过程（尤其是骨骼形成）的影响尚不明确。鉴于加工食品消费量的增加及其相关的饮食氧化应激因素，阐明二酪氨酸的发育毒性具有重要的科学和公共卫生意义。
斑马鱼（Danio rerio）是发育毒理学中的经典模型，具有光学透明度高、发育速度快以及与人类在骨骼和内分泌途径上高度遗传相似性等优点（Bensimon-Brito et al., 2016; Bird & Mabee, 2003; Sun et al., 2021; Tonelli et al., 2020）。其骨骼系统特征明显，行为输出可量化，使得分子扰动与形态和功能结果之间的关联性强。重要的是，新兴证据表明肠道微生物群与骨骼稳态之间存在双向关系，即所谓的“肠道-骨骼轴”（Zhang, Wu et al., 2024）。这种相互作用通过多种机制实现，包括免疫调节、营养素生物利用度的改变以及微生物直接产生的影响破骨细胞和成骨细胞活性的代谢物（R. Li et al., 2024; You et al., 2025; Zhang, Song, et al., 2024; Zhang, Wu, et al., 2024）。因此，微生物组成与骨量调节密切相关（Lyu et al., 2024）。益生菌能够调节肠道微生物生态和宿主的免疫-代谢反应（Yang et al., 2022），在缓解各种毒理和发育损伤方面显示出潜力（Barali? et al., 2023; H. Li et al., 2025; Majlesi et al., 2017; Sun et al., 2021）。然而，它们对抗二酪氨酸等饮食氧化剂引起的骨骼发育毒性的潜力尚未得到研究。基于肠道-骨骼轴的作用及益生菌的调节能力，我们假设益生菌补充可能改善发育中斑马鱼的二酪氨酸诱导的骨骼缺陷。本研究旨在验证这一假设，连接饮食毒理学、骨骼生物学和微生物组靶向策略等领域。
结构上，二酪氨酸是三碘甲状腺原氨酸（T3）的分子类似物，对甲状腺激素受体β1（TRβ1）具有高结合亲和力，表明其可能是一种内分泌干扰化合物（Lu et al., 2020; Wang et al., 2018）。鉴于甲状腺激素信号通路及其下游效应器（包括PI3K/AKT和WNT/β-Catenin通路）在软骨形成和成骨中的关键作用（Kim & Mohan, 2013），我们推测二酪氨酸可能通过干扰这些关键调控网络来损害骨骼发育。
因此，本研究旨在系统评估二酪氨酸对斑马鱼幼体骨骼发育和运动行为的影响，并评估新型益生菌Lacticaseibacillus rhamnosus NKU FL1-11的保护效果。此外，我们希望通过整合分析肠道微生物群和关键成骨信号通路来阐明其作用机制。这项研究为二酪氨酸的骨骼发育毒性提供了新的见解和理论基础，并提出了一种针对微生物组的饮食策略以减轻其不良影响。
化学物质和试剂
二酪氨酸（纯度≥99.91%）购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 junction）。丁酸由Sigma-Aldrich Chemical Corporation（美国密苏里州圣路易斯）生产。阿尔辛蓝和茜素红S溶液由Macklin Biochemical Technology Co., Ltd（中国上海）提供。苏木精和伊红（H&E）染色试剂盒购自Beyotime Biotechnology（中国上海）。ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix购自Vazyme Biotech（美国新泽西州皮斯卡特维）。
二酪氨酸损害斑马鱼幼体的运动行为
斑马鱼的自主运动反映了其发育状态和运动功能，是骨骼发育缺陷的行为指标（Chen et al., 2022）。因此，我们评估了各实验组幼体的运动能力（图1）。轨迹图和热图显示，与对照组相比，二酪氨酸暴露组的运动模式发生了改变（图1A-B）。定量分析表明，总行驶距离和平均移动速度均受到影响。
讨论
二酪氨酸是蛋白质氧化的特征产物，具有累积毒性和多器官效应，主要通过氧化应激介导（B. Li et al., 2023）。最新证据表明，二酪氨酸会在模拟的体外消化模型中引起结肠组织的组织病理学损伤并改变微生物组成（Ding et al., 2023），这凸显了有效抗氧化剂和肠道微生物群调节剂的迫切需求以对抗其不良影响。
结论
总之，本研究证实二酪氨酸是一种强效的骨毒性物质，通过作为内分泌干扰物与TRβ1竞争性结合，进而抑制PI3K/AKT和WNT/β-Catenin信号通路，从而干扰骨骼发育。重要的是，我们发现新型益生菌Lacticaseibacillus rhamnosus NKU FL1-11能有效对抗这些不良影响。
作者贡献声明
Weiye Liu：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、实验实施、数据分析。
Dan Li：撰写初稿、数据可视化、方法学设计、实验实施、数据分析。
Haiwei Liu：方法学设计、实验实施。
Xiang Gao：方法学设计、实验实施。
Yingshuang Lu：研究监督。
Yuekun Wu：实验实施。
Huan Lv：研究监督。
Jin Wang：研究监督。
Shuo Wang：撰写、审稿与编辑、研究监督、资金获取、概念构思。
Yan Zhang：撰写、审稿与编辑。
未引用参考文献
Li et al., 2023; Li et al., 2025; Li et al., 2024; Zhang et al., 2024; Zhang et al., 2024.
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究的利益冲突。
数据可用性
数据可应要求提供。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（2022YFF1100705）的支持。
