《Food Bioscience》：16S rDNA sequencing combined with non-targeted metabolomics profiling reveals the mechanism of simulated digestion ultra-sound pea protein isolate
in vitro
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豌豆蛋白 isolate（PPI）超声处理后肠道菌群及代谢物变化研究。采用动态模拟人类消化系统（SHIME）结合16S rDNA测序与非靶向代谢组学技术，发现超声处理（40分钟，600W）显著增加肠道菌群丰度、多样性和稳态，Firmicutes门水平增幅最显著，差异代谢物涉及甘油磷脂代谢、精氨酸生物合成及氨基酸代谢，为改性PPI在食品工业中的应用提供理论依据。
赵新宇|董雪梅|方建科|李春|赵琳|张国芳|杜鹏|张同|孙新瑶|刘立波|郭文奎
教育部乳品科学重点实验室，东北农业大学，哈尔滨150030，中国
摘要：
豌豆蛋白分离物（PPI）是一种高质量的植物蛋白来源。经过超声处理后，其性能得到了改善，但目前尚不清楚超声处理对肠道菌群及其代谢产物的影响。在本研究中，我们利用16S rDNA和非靶向代谢组学的组合技术，探讨了超声处理对人类肠道微生物组成的影响以及在动态模拟的人类消化条件下的消化代谢产物差异。
结果表明，与未经处理的PPI组相比，经过超声处理（40分钟，功率：600瓦）的PPI显著增加了肠道微生物的丰度、多样性和稳态（P < 0.05），其中有益细菌门（Firmicutes）的丰度增加最为明显。两组之间鉴定出的代谢产物共有53种，其中37种上调，16种下调。这些差异产物的主要代谢途径包括甘油磷脂代谢、精氨酸生物合成和氨基酸代谢。本研究表明，超声处理的PPI可以影响模拟人体消化系统中的肠道菌群组成，从而影响PPI的消化代谢模式。本研究为PPI在食品工业中的应用提供了理论基础。
引言
随着人们生活水平的提高，他们越来越倾向于健康饮食（Toews & Wang, 2013），天然来源的植物基产品越来越受欢迎。其中，豌豆蛋白分离物（PPI）因其营养价值而脱颖而出。此外，PPI富含赖氨酸，其含量高于其他谷物蛋白，能够调节身体的代谢平衡并促进人类的生长发育（M. V. Pol, A. N. Hristov, S. Zaman and N. Delano, 2008; Mertens et al., 2012）。然而，PPI在功能特性方面存在局限性。目前，食品工业通过物理、化学、生物、酶学等方法对蛋白质进行改性以获得良好的效果（J. Boye, F. Zare and A. Pletch, 2010; Lam et al., 2018）。由于超声技术具有处理速度快、能耗低、营养储存效率高以及能够改变食品特性的优点，已成为食品工业中广泛使用的物理改性技术（F. Chemat, Zill-e-Huma and M. K. Khan, 2011）。
研究发现，经过高强度超声处理后，PPI的溶解度和表面疏水性显著提高，颗粒大小减小，凝胶强度增强（Ozkan et al., 2024; Tahir et al., 2024, 2025）。这一现象也在其他蛋白质中得到了验证，例如莲子蛋白（Lu et al., 2026）和大豆蛋白分离物（Ma et al., 2022）。在实际应用中，超声技术展示了提高蛋白质提取率和产品质量的潜力。例如，超声处理可以将脱脂小麦胚芽中目标蛋白质的提取率从37%提高到57%（Zhu et al., 2009）；它还能提高豆浆中蛋白质的溶解度，从而使豆浆的提取率增加10%（Preece et al., 2017）。尽管经过改性后PPI的功能特性有所改善，但其对肠道菌群和代谢的影响仍不清楚。近几十年的科学研究表明，体外模拟的胃肠道消化系统已成为研究饮食摄入对生理反应以及食物消化过程对人类健康状况动态影响的重要工具（Chen et al., 2021; Sivieri et al., 2013）。
16S rDNA测序是一种敏感、快速且准确的细菌组学分析方法，可以更全面地评估宿主体内的微生物群落组成（Lu et al., 2019）。该技术已被广泛用于研究不同膳食蛋白质（如酪蛋白、豌豆蛋白（Patterson et al., 2025）和红小豆蛋白分离物（Mastrolonardo et al., 2025）对肠道微生物群的影响。代谢组学是对特定生物样本中的小分子代谢产物进行定性和定量研究的方法。组织组学技术已被广泛使用并进一步发展，成为探索生命奥秘和生命生理机制的关键技术工具（Liu et al., 2017）。与单一组织学方法相比，组织学的结合能够更深入地阐明疾病的发生机制（Olivier et al., 2019）。通过将16S rDNA测序技术与非靶向代谢组学相结合进行分析，研究人员能够将不同的菌群变化与代谢产物变化紧密联系起来，从而更深入地了解药物或疾病对生物体的影响。Senbiao Shu等人（Shu et al., 2024）通过16S rDNA和代谢组学分析表明，不同热处理引起的牦牛奶蛋白变化可以重塑肠道微生物群组成及其代谢。值得注意的是，并非所有干预措施都会同时影响微生物群落结构和代谢功能。研究发现，未消化的甘氨酸化小豆蛋白和未消化的甘氨酸化绿豆蛋白可以调节肠道微生物群组成，但对代谢谱没有显著影响（Boachie et al., 2023）。该方法已成功应用于阐明高盐诱导的高血压（HSIH）的发病机制（Yan et al., 2020）以及中药成分治疗溃疡性结肠炎的机制（Wu et al., 2020）。
先前的研究表明，超声处理的PPI在功能特性方面有所增强，如颗粒大小减小、起泡性和乳化能力提高，但其对肠道菌群和代谢的影响仍不清楚（Liu et al., 2024）。因此，在本研究中，使用体外动态消化（SHIME）模型来模拟人体消化系统，并利用16S rDNA和非靶向代谢组学来探讨超声处理PPI对肠道菌群及其代谢产物的具体影响，为改性PPI在食品领域的应用提供了科学依据。
材料与化学品
PPI（纯度≥90%）及其他原材料购自元叶生物制品有限公司（上海，中国）。所有其他化学品和试剂均由北京Biotop科技有限公司（中国）提供，均为分析级。
豌豆蛋白分离物的超声处理
采用Liu等人的研究方法（Liu et al., 2024）。选择经过40分钟超声处理（超声功率：600瓦；脉冲持续时间：2秒开启，3秒关闭）的PPI作为处理组，未经过超声处理的PPI作为对照组。
动态SHIME
根据SHIME的要求，配置反应器
肠道菌群的Alpha多样性分析
Alpha多样性分析主要用于反映单个样本内的微生物丰富度和均匀性。在本研究中，观察到在达到某一阶段后，稀疏曲线和Shannon多样性指数曲线都呈现平稳趋势（图1A）。这一观察结果证明了选择测序数据量的合理性，确保了数据的充分性和代表性。此外，它有效地反映了……
讨论
肠道内含有多达1,014种微生物，被称为“第二个人类基因组”。肠道菌群的多样性可以反映人体微生态的稳态，其丰度对人体营养物质的利用和吸收以及免疫系统的调节至关重要。这些菌群及其产生的代谢产物的结构、种类和功能的变化在……
结论
本研究结合了16S rDNA测序和LC-MS代谢组学方法，统计分析了超声处理PPI对人类代谢谱和微生物群落特征的影响。研究表明，添加超声处理后的肠道微生物门和属的丰度发生了变化，从而增加了肠道菌群的丰富度、多样性和均匀性，但有益细菌的丰度有所增加
作者贡献声明
赵新宇：撰写——初稿、方法学、数据管理。
刘立波：项目管理、资金获取。
郭文奎：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。
张国芳：撰写——审稿与编辑、资金获取、概念构思。
杜鹏：项目管理、数据管理。
张同：资源获取、数据管理。
孙新瑶：资源获取、概念构思。
董雪梅：方法学、数据管理。
未引用的参考文献
Chemat et al., 2011; Boye et al., 2010; Pol et al., 2008.
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
