《Food and Chemical Toxicology》：The larvicide temephos decreases the fertilization rate of rat spermatozoa by altering different processes of the acrosome reaction and actin polymerization
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敌敌畏长期暴露可显著降低精子受精率，机制涉及酪氨酸磷酸化抑制、微丝聚合异常及IZUMO1蛋白迁移受阻，同时伴随丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平升高。
Ailemys Curbelo-Valiente | Ana Lilian Roa-Espitia | Gabriela Mishell Moreno-Bustamante | María de Jesús Solís-Heredia | Dennis Tafoya-Domínguez | Enrique Othón Hernández-González | Betzabet Quintanilla-Vega
墨西哥国立自治大学（Cinvestav）研究与发展中心毒理学系，IPN 2508路，圣佩德罗萨卡滕科，墨西哥城，07360
摘要
Temephos是一种用于防治疾病媒介的杀虫剂，被归类为轻度毒性物质。然而，它会对精子功能产生不良影响，但其具体机制尚不清楚。在受精过程中，精子会发生 capacitation（ capacitation 是指精子准备与卵子结合的过程），同时蛋白质会发生酪氨酸磷酸化（p-Tyr）。随后，肌动蛋白细胞骨架会发生重塑，这对顶体反应（acrosome reaction，AR）至关重要。在顶体反应过程中，IZUMO1蛋白的重新定位也是配子融合的必要条件。本研究旨在探讨Temephos如何影响雄性大鼠的受精能力，实验中大鼠每天接受10毫克或100毫克的Temephos处理，持续5天（分别对应世界卫生组织规定的无观测不良效应水平NOAEL和最低观测不良效应水平LOAEL），并在处理后第1天处死。精子样本取自附睾和输精管。结果显示，每天接受10毫克Temephos处理时未观察到明显影响；而每天接受100毫克Temephos处理时，受精率下降了22%，且氯四环素检测显示Ca2+离子介导的顶体反应受到抑制（降低了49%），表明精子功能受损。这一现象进一步通过p-Tyr磷酸化和肌动蛋白聚合减少得到证实，这两种变化都影响了IZUMO1蛋白的重新定位。这些结果表明，Temephos通过降低精子的 capacitation 和肌动蛋白聚合能力，从而影响了受精过程。
引言
全球范围内一个重大的公共卫生问题是生育能力下降，尤其是男性生育能力下降。多项研究表明，环境污染物（尤其是杀虫剂）会对男性生殖系统产生毒性作用。Temephos是一种有机磷（OP）杀虫剂，在墨西哥被广泛用于防治传播登革热、寨卡病毒和基孔肯雅热等疾病的蚊子幼虫。世界卫生组织（WHO）将Temephos归类为轻度毒性物质，其最低观测不良效应水平（LOAEL）为每天100毫克，持续44天；而无观测不良效应水平（NOAEL）为每天10毫克，同样持续44天（基于神经毒性症状的评估）。然而，美国环境保护署（EPA）则将其归类为中等毒性物质。
关于Temephos的毒性研究有限，尤其是其对男性生殖系统的影响。有研究显示，雄性大鼠每天接受100毫克Temephos处理5天后，乙酰胆碱酯酶（AChE）活性受到抑制，精子活力和存活率下降，受精卵比例降低，2-4细胞胚胎的数量也减少（Ramos-Flores等人，2021年）。但Temephos导致这些效应的具体作用机制尚不清楚。最近的研究发现，Temephos在肝脏中会代谢产生多种活性代谢物，其中一些具有内分泌干扰作用，如4,4’-硫代二酚（TDP）和4,4’-磺酰二酚或双酚S（BPS）（Verdín-Betancourt等人，2021年）。
在受精过程中，精子会获得高度活动性，并发展出与卵子膜结合的能力，这一过程称为 capacitation。在 capacitation 期间，多种精子蛋白会发生酪氨酸磷酸化（p-Tyr），这一过程由环腺苷单磷酸（cAMP）依赖的信号通路调控，主要涉及蛋白激酶A（PKA）和Src家族激酶（Baker等人，2006年；Mitchell等人，2008年）。酪氨酸磷酸化是精子 capacitation 的标志。同时，肌动蛋白也会在 capacitation 期间发生聚合（Ramírez-Ramírez等人，2020年），这对精子的高活性运动、顶体反应（AR）以及细胞内蛋白质运输至关重要（Sosnik等人，2010年）。顶体反应是受精的关键步骤，包括顶体中的水解酶通过胞吐作用释放出来，以及卵子膜与顶体膜的融合（Aldana等人，2021年）。配子间的相互作用也是受精所必需的，其中精子蛋白IZUMO1的重新定位起着关键作用。
先前的研究表明，Temephos处理会直接影响精子在附睾中的功能；因此，本研究旨在探讨Temephos如何影响精子的受精能力，具体包括 capacitation、顶体反应、肌动蛋白聚合以及与配子相互作用相关的蛋白质（如IZUMO1）的重新定位。
试剂
Temephos [O,O,O’,O’-tetramethyl-O,O’-thiodi-p-phenylene bis (phosphorothionate)] 由T.M. FOS 500 CE（Agromundo, S.A. de C.V., 墨西哥城）纯化（纯度超过97%）（Verdín-Betancourt等人，2019年）。使用的其他试剂包括牛血清白蛋白（BSA）、甲醛、5-5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸（DTNB）、乙酰硫代胆碱碘化物、伊红Y、人绒毛膜促性腺激素（hCG）、Triton X-100、碘乙酰胺、苯胺苄胺、抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟（PMSF）等。
Temephos对AChE活性的影响
每天接受10毫克Temephos处理5天后，AChE活性未受抑制；而在每天接受100毫克Temephos处理5天后，第3天和第5天时AChE活性分别下降了64%和76%（p < 0.05）。
Temephos对精子质量的影响
每天接受10毫克或100毫克Temephos处理的动物在精子质量参数（活力、存活率或形态）方面没有显著差异（表1）。
Temephos降低了受精率
雄性大鼠每天接受10毫克或100毫克Temephos处理后……（原文此处内容不完整）
讨论
Temephos（商品名Abate?）是热带国家（如墨西哥）广泛使用的杀虫剂，主要用于防治传播登革热的埃及伊蚊（Aedes aegypti）。WHO将Temephos归类为轻度毒性物质，并建议其在饮用水中的使用浓度不超过1毫克/升（WHO，2009年）。尽管关于Temephos的毒性研究较少，但最近的体内研究表明其具有毒性，并且在肝脏中会经历广泛代谢（
结论
研究结果表明，雄性大鼠每天接受100毫克Temephos处理5天后，受精率下降，这与精子 capacitation、肌动蛋白细胞骨架重塑、顶体反应（AR）以及IZUMO1蛋白重新定位等关键过程的改变有关，证实了Temephos对男性生殖系统的不良影响。在蚊子流行地区，Temephos是防治埃及伊蚊的首选杀虫剂。
作者贡献声明
Enrique Othón Hernández-González： 负责写作、审稿与编辑、研究设计及概念框架的制定。
Betzabet Quintanilla-Vega： 负责写作、审稿与编辑、初稿撰写、研究设计、数据分析及概念框架的制定。
María de Jesús Solís-Heredia： 负责写作、审稿与编辑、方法学设计、研究实施及数据分析。
Dennis Tafoya-Domínguez： 负责方法学设计及数据分析。
Ana Lilian Roa-Espitia： 负责写作、审稿与编辑、方法学设计及数据分析。
未引用的参考文献
Esteves和S，2011；《实验室动物护理和使用指南》；Mu?oz；Temephos RED；世界卫生组织，2009年。
利益冲突声明
作者们声明没有需要披露的利益冲突。
动物实验程序
所有动物实验均严格遵循《实验室动物护理和使用指南》（The Guide, 2011, NRC, USA）中的伦理原则，确保实验动物的福利。本研究获得了动物护理和使用机构委员会以及墨西哥动物保护官方标准（NOM-062-ZOO-1999）的批准。
资金支持
本研究部分得到了墨西哥科学、人文、技术和创新部（SECIHTI）的资助（项目编号：CBF-2023-2024-1894，资助对象为EOH-G）。
作者利益冲突声明
? 作者声明以下可能构成利益冲突的财务关系/个人关系：Enrique Othón Hernandez-Gonzalez表示获得了墨西哥科学、人文、技术和创新部的财政支持。其他作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢Gerardo Martínez-Aguilar在实验中的技术协助，以及Benjamín Emmanuel Chávez-Alvarez、Alberto Rojo-García和Carlos Giovanni Sam-Miranda在动物实验方面的技术支持。AC-V和GMM-B获得了墨西哥科学、人文、技术和创新部的奖学金。
