基于双发射持久发光的比率型适配体传感器，无需互补链和原位激发，可准确检测生物活性乳铁蛋白

《Food Chemistry》：Dual-emitting persistent luminescence-based Ratiometric Aptasensor without complementary-strand and in-situ excitation for accurate detection of bioactive Lactoferrin

乳铁蛋白生物活性检测采用双发射ZnGa2O4:Cr0.0001持久发光纳米粒子与特异性aptamer结合的比率aptasensor，通过Cy淬灭剂实现520nm与714nm信号比值变化进行定量，无需互补链标记，检测限56.24 ng/mL，适用于乳制品等复杂基质。

　　

金彦军|郭静轩|严珠英|陈丽健|严秀萍|赵旭

江南大学食品科学与技术学院分析食品安全研究所，中国无锡214122

摘要

快速定量生物活性乳铁蛋白（LF）对食品安全和营养至关重要。我们开发了一种比率型适配体传感器，该传感器将LF特异性适配体与双发射ZnGa₂O₄:Cr_0.0001持久发光纳米粒子（520 nm和714 nm）结合在一起，以实现生物活性LF的准确检测。与传统使用淬灭剂标记的cDNA不同，我们使用Cy染料通过共振能量转移抑制714 nm信号。当存在LF时，LF会与适配体-Cy相互作用，释放Cy并恢复714 nm的发射强度，而520 nm信号保持不变，用于内部校准。该传感器消除了杂交和原位激发过程，降低了成本和复杂性。其线性范围为600–1100 ng/mL^?1，检测限为56.24 ng/mL^?1，选择性优异。在乳制品和营养强化剂中，生物活性LF的定量回收率为96.5%–102.3%；同时准确测定了各种热处理导致的失活速率，验证了该传感器在质量控制应用中的有效性。

引言

乳铁蛋白（LF）是一种分子量约为80 kD的铁结合阳离子糖蛋白，含有约700个氨基酸（Hu等人，2024年）。它主要存在于初乳、母乳、眼泪和其他生物液中（Abedi-Firoozjah等人，2025年；Shini等人，2022年）。LF具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒、抗癌、促进基因转录、促进骨骼再生、抑制寄生虫生长和抗衰老作用（Hong等人，2024年；Li & Guo，2021年；Telang，2018年）。值得注意的是，生物活性LF对婴儿和幼儿的健康至关重要，可促进大脑和神经系统的发育，增强免疫能力并促进肠道成熟（Jiang等人，2024年）。因此，LF通常被添加到婴儿配方奶粉中作为营养强化剂。然而，在制造过程中的热处理（如巴氏杀菌、蒸发和喷雾干燥）容易导致LF变性或聚集，从而显著降低其生物活性（Li等人，2022年）。因此，开发一种快速且灵敏的生物活性LF检测方法对于确保准确定量和严格质量控制至关重要。

目前的常规LF检测方法（如高效液相色谱法（Yuan等人，2021年）和酶联免疫吸附测定法（Wang等人，2021年）需要复杂的样品预处理步骤，检测时间较长，并且难以区分结构相似的蛋白质。近年来，开发了几种快速检测技术，包括径向免疫扩散（Niero等人，2023年）、表面等离子体共振传感器（Liu等人，2022年）、毛细管电泳（Chen等人，2021年）和荧光传感器（Culver等人，2018年）。其中，荧光传感器因其高精度、低成本和操作简便性而受到关注（Hong等人，2021年；Keerthana等人，2021年；Han等人，2020年；Wang等人，2021年；Deshpande & Kanungo，2023年；Chen等人，2017年；Nangare等人，2022年）。然而，传统的荧光方法需要连续激发，这会导致复杂基质产生强烈的自荧光（Wu等人，2020年）。这种干扰在食品、环境和生物样本等复杂样本中尤为明显，影响定量准确性。此外，大多数现有传感平台难以区分生物活性LF与变性或聚集的LF。因此，开发一种能够选择性检测生物活性LF的快速且超灵敏的分析平台在技术上具有挑战性，但在科学上也非常重要。

持久发光纳米粒子（PLNP）是一代新型光学探针，无需原位激发即可工作，具有出色的信噪比，并且对基质自荧光具有内在抗性（Algar等人，2021年）。这些优势有效克服了传统荧光团的长期缺点，使PLNP在诸如治疗诊断（Zhao等人，2023年；Zhao等人，2024年）、长期追踪（Hao等人，2024年；Yu等人，2023年）和生物传感（Jiang等人，2020年；Yin等人，2021年）等应用领域得到广泛应用。然而，单波长PLNP容易受到各种外部因素（仪器波动、环境干扰、操作者差异、仪器效率）和探针浓度的影响，这些因素都会影响定量准确性。整合内部参考信号以自校准读数并消除外部干扰对于准确分析至关重要（Hu等人，2023年；Shi等人，2020年）。因此，构建一种仅对生物活性LF响应的比率型PLNP传感器为实现超灵敏检测提供了有希望的途径，同时背景干扰可忽略不计。

适配体是从随机文库中通过指数富集系统进化方法筛选出的短单链寡核苷酸，能够以高特异性和亲和力结合目标分子（Tian等人，2024年）。与酶和抗体相比，适配体具有更低的生产成本、更宽的靶向范围和更好的生理稳定性，使其成为生物传感器的理想识别元件（Liu等人，2022年）。先前的研究已成功筛选出能够特异性识别并结合LF的适配体（Liu等人，2017年），揭示了其选择性结合生物活性LF的潜力（Huang等人，2023年）。然而，大多数现有的适配体传感器仍依赖于与适配体杂交的淬灭剂标记互补链来产生信号变化（Guo等人，2023年；Pan等人，2022年），这带来了成本高、多步骤标记和操作复杂等问题。因此，筛选能够选择性识别生物活性LF的适配体并将其整合到简洁而稳健的适配体传感器中以实现超灵敏和低背景检测仍然是一个重大挑战。

在这里，我们报道了一种基于双发射PLNP的比率型荧光适配体传感器，用于复杂食品样本中生物活性LF的快速准确分析。首先制备了在714 nm（分析通道）和520 nm（参考通道）具有持久发光的双发射PLNP（ZnGa₂O₄:Cr_0.0001），作为自校准信号单元。然后，将选择性识别生物活性LF的适配体与双发射PLNP共价连接，随后通过静电吸附、氢键和π-π相互作用将阳离子染料Cy吸附到适配体上，形成淬灭型适配体（PLNP-apt@Cy）。当存在生物活性LF时，LF会特异性结合到适配体上，释放Cy并破坏共振能量转移，从而恢复714 nm的红色发射，而520 nm的绿色信号保持不变，实现生物活性LF的准确比率检测。所开发的比率型适配体传感器无需互补链标记，对基质荧光和外部因素具有抗性，能够在复杂食品基质中实现生物活性LF的灵敏和低背景检测。

部分内容

适配体修饰PLNP（PLNP-apt）的制备

首先根据我们之前的报道（Pan等人，2022年）合成并氨基功能化了双发射PLNP（ZnGa₂O₄:Cr_0.0001）。然后使用PLNP-NH₂（1.0 mg）和Sulfo-SMCC（0.3 mg）在1.0 mL HEPES缓冲液（10 mM，pH 7.2）中通过超声处理分散，随后在25°C下振荡2小时。之后，将混合物离心（9020 × g，10分钟），并用PBS缓冲液（10 mM，pH 7.4）洗涤

适配体传感器的设计与构建

图1展示了比率型适配体的设计和识别机制。由于PLNP无需原位激发且背景荧光干扰低，选择了在520 nm和714 nm具有双发射特性的ZnGa₂O₄:Cr_0.0001作为信号单元来构建自校准传感器。为了特异性识别生物活性LF，将巯基末端（5’-SH）LF适配体（表S1）通过杂双功能交联剂Sulfo-SMCC连接到PLNP-NH₂上

结论

我们开发了一种基于双发射持久发光的比率型适配体传感器，用于生物活性LF的快速准确检测。通过将持久发光与适配体特异性识别相结合，该传感器无需原位激发，不受基质自荧光和外部干扰的影响，具有高信噪比、优异的特异性和出色的精度。值得注意的是，该传感器设计中不使用任何互补链，从而避免了

CRediT作者贡献声明

金彦军：研究、方法学、数据整理、验证、正式分析、撰写初稿。郭静轩：方法学、验证、监督。严珠英和陈丽健：验证和正式分析。严秀萍：监督、资源提供以及写作审查和编辑。赵旭：概念构思、项目管理、监督、资金获取、正式分析、写作审查和编辑。

未引用参考文献

S, Sam, George, N and Varghese, 2021

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号22574066和22206060）和江苏省基础研究计划（编号BK20231491）的支持。