对711份不同大豆种质资源中的A组和B组种子皂苷进行的高分辨率HPLC-MS/MS分析

《Food Chemistry》：High-resolution HPLC-MS/MS profiling of group a and group B seed saponins in 711 diverse soybean germplasms

大豆种质资源中皂苷含量的多环境分析及分布规律研究。采用优化HPLC-MS/MS方法定量检测711份大豆种质中A、B型皂苷，发现总皂苷含量受基因型、种子颜色、组织部位及生态区显著影响，黑种皮种质总皂苷含量达6764.67 μg/g，与油脂正相关、蛋白质负相关。地理分布表明北方和黄淮海地区种质皂苷含量最高，为功能食品开发提供资源依据。

　　

作者名单：Adebabay Tazeb、Shengrui Zhang、Yanan Hou、Azhar Iqbal、Aimal Nawaz Khattak、Muhammad Ahsan、Emmanuel Kofi Sie、Jing Li、Bin Li、Junming Sun

机构名称：国家作物基因资源与育种重点实验室、作物分子育种国家工程技术研究中心、中国农业科学院大豆生物学重点实验室（北京），中国北京100081

摘要

大豆种子富含皂苷，但其在不同种质资源和环境条件下的变异情况尚未得到充分研究。我们开发了一种HPLC–MS/MS方法来提取和定量A组和B组皂苷，并对711个大豆样本在四种环境下的皂苷含量进行了分析。基因型、样本类型、生态区域、种皮颜色和种子组织均显著影响皂苷含量，其变化幅度可达5倍（1376.19–6764.67 μg/g）。A组皂苷占主导地位（77.5%），其中Ab（46.0%）和Aa（23.0%）为主要成分。黑籽样本的总皂苷含量最高。此外，下胚轴中的总皂苷含量也较高（45,230.40 μg/g；其中93.5%为A组皂苷）。总皂苷含量与所有成分（Af除外）及油脂含量呈正相关，但与蛋白质含量呈负相关。地理分布显示，北方地区和黄淮海地区样本的A组及总皂苷含量较高。本研究为了解大豆种子中的皂苷组成提供了全面而新的见解，并筛选出了具有优良皂苷特性的优良样本，有助于育种和工业应用。

引言

大豆（Glycine max L. Merr.）大约在4500年前在中国被驯化（Qiu等人，2011年），其丰富的种质资源已在全球范围内得到收集和传播。大豆是蛋白质、植物油及多种具有健康促进作用的生物活性化合物的主要来源（Kassem，2021年）。近年来，由于含有异黄酮（Azam等人，2020年）、类胡萝卜素（Gebregziabher等人，2022年）、黄酮类（Iqbal等人，2025年）、核黄素（Khattak等人，2025年）、叶酸（Agyenim-Boateng等人，2022年）、可溶性糖（Qi等人，2022年）和脂肪酸（Abdelghany等人，2020年）等成分，大豆作为功能性食品受到了关注。

皂苷是一类两亲性的次生代谢产物，由三萜或甾体苷元与糖链结合而成。由于其结构多样性，皂苷具有多种生物活性，包括降低胆固醇、抗炎、抗氧化和心脏保护作用，并有助于植物抵御微生物和病原体（Ligor, Kielbasa, Ratiu, & Buszewski, 2021; Nguyen等人，2020; Yates, Roberson, Ramsue, & Song, 2021）。它们的表面活性使其在食品工业中可作为天然乳化剂和发泡剂使用（Timilsena, Phosanam, & Stockmann, 2023）。

根据苷元结构的不同，大豆皂苷可分为A组、B组、DDMP组、E组、α组和β组（Heng等人，2006年；Kamo, Suzuki, & Sato, 2014年）。其中A组和B组皂苷占主导地位，其结构和生物学功能已被明确界定。A组皂苷以大豆皂苷元A为主，C-22位点发生乙酰化，进一步分为Aa、Ab、A0和A亚类（Takahashi, Li, Tsukamoto, & Wang, 2018）；Aa和Ab具有抗肥胖、抗炎、保护结肠和肺部的作用（Lin等人，2016年；Yang等人，2015年），但其乙酰化会赋予大豆制品强烈的苦味和涩味（Chitisankul等人，2018年）。相比之下，B组皂苷以大豆皂苷元B为主，C-22位点未发生乙酰化，主要以热不稳定的DDMP形式存在，在加工过程中会转化为B型皂苷（例如Ba[V]、Bb[I]、Bb’[III]（Sundaramoorthy等人，2019年）；这些皂苷具有抗癌、保肝、抗炎和心血管保护作用（Gurfinkel & Rao, 2003; Hsu等人，2005; Kinjo等人，2000）。α组和β组皂苷以及E组皂苷也存在于大豆种子中，但它们对人类健康的影响尚待证实（Chitisankul等人，2021年；Itabashi等人，2016年）。总体而言，A组皂苷具有溶血作用、苦味，并具有结合胆固醇的能力（Marrelli, Conforti, Araniti, & Statti, 2016; Xiao, Li, Pei, Gu, & Piao, 2025），而B组皂苷在清除自由基和抗炎方面更具活性（Luo等人，2022年；Lv等人，2024年）。这些不同的活性使它们成为营养保健品和工业育种研究的主要目标。

大豆种子中的皂苷含量和组成受遗传背景、环境和农艺条件、生长季节以及分析方法的影响（Huang等人，2012年；Sundaramoorthy等人，2019年；Szikiel, P?czkowski, & Henry, 2011年）。基因型差异对总皂苷含量影响显著，尤其是A组皂苷；B组皂苷在不同大豆品种间的组成差异较小（Shiraiwa, Harada, & Okubo, 1991年）。A组和B组皂苷在种子中的分布不均：超过90%的A组皂苷集中在下胚轴中，约占干重的2–3%，而B组皂苷在下胚轴和子叶中分布较为均匀，仅在种皮中以微量存在（Berhow, Kong, Vermillion, & Duval, 2006年；Chitisankul等人，2018年；Krishnamurthy等人，2014年）。因此，全籽分析往往会因子叶的稀释而低估A组皂苷含量，这突显了了解空间分布对于识别具有理想皂苷特性的基因型的重要性。

尽管皂苷对人类健康和营养具有重要价值，但目前对大豆种质中皂苷的研究仍不充分，且对其亚类的研究较为零散和有限。现有的大多数研究主要侧重于通过定性分析来检测主要皂苷组（Takahashi等人，2017年），使用的小样本量限制了研究结果的广泛应用。例如，Chitisankul等人（2018年）仅使用LC–PDA–MS/MS方法分析了九个大豆品种子叶和下胚轴中主要皂苷组的定性和定量变化；Berhow等人（2006年）通过LC–MS评估了四种大豆品种中A组和B组皂苷的组成差异。类似地，Omizu等人（2011年）使用LC–PDA–MS/MS测定了15个大豆品种的种子皂苷组成和含量；Hu等人（2002年）使用HPLC比较了46个大豆品种的B组皂苷含量。另有研究仅报道了两种大豆品种的皂苷变化（Kim等人，2006年）。因此，对多种环境下的大量大豆种质进行全面的定量分析仍十分有限，限制了我们对可用于育种和功能性食品开发的自然变异程度的理解。因此，关于不同种质间的定量变异范围、导致这种变异的遗传和环境因素以及单个皂苷的组成多样性，仍存在许多知识空白。本研究分析了711个多样化的大豆种质，包括具有不同育种和驯化历史的人工品种和地方品种，以捕捉广泛的遗传多样性并发现可用于改良和育种的天然变异。这些样本来自中国三个主要大豆生态区域：北方地区（NR）、黄淮海地区（HR）和南方地区（SR），纬度范围为19.1°N至53°N（Song等人，2016年）。

此外，对大量多样化的种质中单个皂苷成分进行系统的高通量HPLC-MS/MS分析较为罕见，因此A组和B组皂苷之间的自然变异尚未得到充分研究。由于缺乏对其自然变异的认识，这些主要皂苷类在大豆育种中的应用也受到限制。此外，以往的研究均未探讨样本类型、起源生态区域或种皮颜色对多种环境下皂苷组成和含量变化的影响。为填补这一知识空白，我们对一个遗传多样性丰富的大豆样本进行了高分辨率的代谢物分析。我们的目标是：(i) 开发并验证一种HPLC–MS/MS方法，用于定量九种关键皂苷成分：A组（Aa、Ab、Ac、Ae、Af）和B组（Ba[V]、Bb[I]、Bb’[III]、Bc[II]；(ii) 分析711个样本中的这些代谢物；(iii) 评估样本类型、起源生态区域、种皮颜色和种子组织对皂苷变化的影响；(iv) 研究皂苷含量与种子蛋白质、油脂含量及地理变量之间的相关性；(v) 揭示中国主要大豆生态区域中种子皂苷含量的地理分布模式。这些发现为了解大豆种子中的皂苷组成提供了新的见解，并识别出可用于工业应用和育种的优良种质。此外，本研究还为大豆中的皂苷多样性提供了参考，有助于深入理解食品生物化学、生物活性成分及分析方法，同时推动功能性食品和生物技术应用的发展。

植物材料和田间试验

本研究使用了由中国农业科学院作物科学研究所（ICS-CAAS）的高产优质大豆育种研究组培育的大豆品种Zhonghuang 13（高蛋白含量）和Zhonghuang 35（高油含量），进行了方法开发，并对711个大豆样本的皂苷组成进行了分析，这些样本包括357个栽培品种和354个地方品种，均来自中国国家作物基因库。

HPLC-MS/MS的分析物鉴定与优化

成功优化了一种HPLC-MS/MS方法，用于检测大豆种子中的九种皂苷成分。采用35–60%的乙腈溶液、0.1%（v/v）甲酸、0.3 mL/min的流速和5 μL的注射量，在20分钟内进行线性梯度洗脱，实现了高效的色谱分离。正电喷雾离子化（ESI+）能够检测m/z范围为740–1500的前体离子，从而获得无干扰的准确定量结果。

讨论

大豆作为一种重要的作物，不仅因其高蛋白和油脂含量而受到重视，还含有丰富的生物活性化合物（如皂苷）。除了分析特性外，大豆皂苷还具有独特的生化和物理化学性质，为其广泛应用奠定了基础。由于其两亲性，皂苷在食品系统中可作为天然乳化剂、发泡剂和稳定剂，并逐渐被视为功能性食品中的清洁标签成分。

结论

我们开发了一种高通量HPLC-MS/MS方法，全面分析了来自三个主要生态区域（北方地区、黄淮海地区和南方地区）的大量大豆样本中的A组和B组皂苷组成。种子中的皂苷含量受基因型、样本类型、种皮颜色、种子组织、起源生态区域和地理因素的显著影响。大规模分析显示，不同样本、年份和地点之间的总皂苷含量存在五倍的变异。

CRediT作者贡献声明

Adebabay Tazeb：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、数据管理。 Shengrui Zhang：数据可视化、数据分析、概念构思。 Yanan Hou：数据可视化、数据分析、概念构思。 Azhar Iqbal：撰写、审稿与编辑、方法设计、实验设计。 Aimal Nawaz Khattak：方法设计、实验设计。 Muhammad Ahsan：数据可视化、数据分析。 Emmanuel Kofi Sie：数据可视化、数据分析。 Jing Li：资源协调。 Bin Li：撰写。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

感谢中国农业科学院作物科学研究所的Lijuan Qiu博士提供了所有的大豆样本。本研究得到了国家自然科学基金（32272178, 32161143033）和中国农业科学院农业科学技术创新项目（2060302-2）的财政支持。