一种“双滤网”柔性SERS基底：通过分子和物理过滤的协同作用，实现对三种鹅膏毒素亚型的超高灵敏度鉴别

《Food Chemistry》：A “dual-sieve” flexible SERS substrate: Synergistic molecular and physical filtration for ultra-sensitive discrimination of three amanitin subtypes

柔性SERS基材开发及其在AMA亚型快速检测中的应用，采用MIL-101(Cr)、金纳米二棱锥和纤维素纳米纤维构建双筛机制，实现超灵敏（10?? mg/mL）和高效AMA亚型区分，抗基质干扰性能优异，适用于蘑菇中毒筛查和食品安全诊断。

　　

杨逊|范新瑞|丁燕|王立翔|史阳|陈峰|曹月

南京医科大学法医学系，中国南京211166

摘要

鹅膏菌中含有的鹅膏素（AMA）是一种高毒性八肽，由于误识别可能引发严重的中毒风险。本文开发了一种基于MIL-101(Cr)、金纳米双锥体（AuBPs）和纤维素纳米纤维（CNF）的柔性表面增强拉曼光谱（SERS）基底，该基底采用了“双筛”机制来排除杂质。该平台能够实现超灵敏的检测（检出限：10^?8 mg/mL），并快速区分α-、β-和γ-鹅膏素亚型，同时具备出色的抗基质干扰性能。这一方法能够高效地对鹅膏素进行亚型鉴定，为紧急蘑菇中毒筛查和食品安全诊断提供了一种便携且可靠的策略。

引言

食用真菌因其细腻的风味和高营养价值而在丰富人类饮食和提升食物多样性方面发挥着关键作用（Lin等人，2022年；Ye & Liu，2018年）。然而，形态相似的有毒蘑菇（尤其是产生鹅膏素的蘑菇）的存在对全球食品安全构成了持续威胁，世界各地频繁发生中毒事件（Hassan & Vincent，2023年；Iskander等人，2023年），包括在中国云南省——这个以丰富的蘑菇生物多样性而闻名的地区。流行病学研究表明，鹅膏素在中国导致蘑菇相关死亡案例中占比超过70%（Sun等人，2018年）。鹅膏素来源于鹅膏菌属，包括α-、β-和γ-亚型（Tavassoli等人，2019年）：这些双环八肽具有优异的热稳定性和化学稳定性，因此在烹饪过程中不易降解（Abbott等人，2018年）。值得注意的是，鹅膏素对人类的半数致死剂量（LD₅₀）低至每公斤体重0.1毫克，而著名的毒蘑菇毒鹅膏（Amanita phalloides）中的鹅膏素毒素平均含量为每克蘑菇组织0.5至2毫克（Brüggemann等人，1996年）。这些毒素通过肠肝循环引起不可逆的肝脏损伤，导致肝功能衰竭、多器官功能障碍和高死亡率（Letschert等人，2006年；Robinson-Fuentes等人，2008年）。临床上，鹅膏素中毒的潜伏期为6至24小时，初期表现为非特异性胃肠道症状。一个欺骗性的假恢复期（摄入后48至72小时）会掩盖即将发生的严重器官损伤，此时延迟医疗干预会显著降低生存率（Zhou等人，2022年）。因此，快速、可靠地检测食品基质（如生蘑菇、加工产品）中的鹅膏素对于预防性食品安全监管至关重要，而对中毒患者的早期诊断则可以打破这一假恢复过程，改善临床结果。

早期检测鹅膏素的方法依赖于Wieland显色试验（Wieland，1949年），该方法中蘑菇提取物中的鹅膏素在酸性条件下与木质素反应产生特征性的蓝绿色。然而，这种方法特异性较差，因为复杂基质中的羟基二醇会导致假阳性结果。随后引入的¹²⁵I标记的放射免疫测定法（RIA）（H Faulstich等人，1975年；Heinz Faulstich等人，1982年）能够检测生物液体中的鹅膏素，但其临床应用受到放射毒性和与结构相似肽的交叉反应性的限制，从而促使人们开发了替代方法。现代分析技术，包括薄层色谱（TLC）（Stijve & Seeger，2010年）、超高效液相色谱（UPLC）（Barbosa等人，2022年；Mao等人，2022年）、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）（C. Li等人，2017年）、ELISA（Gao等人，2022年）、毛细管电泳（CE）（Zhu等人，2022年）和电化学传感，提高了检测准确性；然而，这些方法受到复杂样品预处理要求、高仪器依赖性以及基质干扰的阻碍——尤其是在血液或尿液等生物样品的痕量分析中。

为了解决这些问题，表面增强拉曼光谱（SERS）作为一种有前景的工具应运而生，它利用贵金属的等离子体效应生成独特的振动指纹，以实现超灵敏的生物分子检测（Szekeres等人，2020年）。结合金属有机框架（MOFs）——多孔晶体材料（Kitagawa等人，2014年），这些材料具有可调的孔结构和出色的物理化学性质（Liu等人，2021年），该平台无需传统SERS中的纳米标记，实现了无标记的选择性分析物富集（Choi等人，2020年）。像MIL-101(Cr)这样的MOFs充当分子筛，排除大分子干扰物，同时允许鹅膏素亚型选择性地与SERS活性金纳米双锥体（AuBPs）结合，从而简化样品制备并提高复杂基质中的检测可靠性。

在本研究中，选择了具有优异比表面积的MIL-101(Cr)作为目标材料。将该材料与AuBPs和纤维素纳米纤维（CNF）结合，并通过真空过滤得到AuBPs@MIL-101(Cr)@CNF柔性SERS基底。MOF和CNF这两种具有过滤性能的材料相结合，形成了“双筛”结构，使基底对样品具有一定的过滤效果，能够检测复杂基质中的小分子和中分子物质。因此，该方法有望用于无需或只需少量样品预处理的血液、尿液和呕吐物检测。此外，使用这种柔性SERS基底首次检测到了三种鹅膏素亚型。结果表明，所开发的基底能够区分α-、β-和γ-鹅膏素类型，具有潜在的临床应急和法医毒理学分析应用前景。

部分内容摘录

MIL-101(Cr)的合成

MIL-101(Cr)是根据之前报道的无氟合成方案（Bromberg等人，2012年）进行适当修改后合成的。首先，将9.0克九水合硝酸铬[Cr(NO₃)₃·9H₂O]和3.735克对苯二甲酸（TPA）溶解在60毫升双蒸水中（ddH₂O）。经过30分钟的超声处理后，将悬浮液转移到100毫升容量的水热反应器的特氟龙内罐中，并在218°C的加热箱中加热18小时。

AuBPs@MIL-101(Cr)@CNF柔性SERS基底的制备及鹅膏素的检测机制

图1A展示了AuBPs@MIL-101(Cr)@CNF柔性SERS基底的制备过程。MIL-101(Cr)是一种具有大介孔的规则八面体MOF，通过无氟水热法合成。制备好的MOF随后与AuBPs混合以促进纳米粒子吸附，再与CNF水溶液混合。通过真空辅助过滤，形成的复合分散体制成了类似凝胶的膜，随后干燥得到独立的柔性基底。

结论

本研究开发了一种柔性AuBPs@MIL-101(Cr)@CNF SERS基底，结合了AuBPs的LSPR效应、MIL-101(Cr)的导电性能以及CNF的机械柔韧性。这种多功能结构在保持轻量化设计、可弯曲性和从复杂表面采样分析物等物理特性的同时，实现了强大的SERS信号增强。该基底可以直接集成到便携式检测设备中，使其

CRediT作者贡献声明

杨逊：撰写——初稿，数据整理，概念构思。范新瑞：数据整理，方法学，验证，撰写——审阅与编辑。丁燕：撰写——审阅与编辑，软件，方法学。王立翔：可视化，软件。史阳：软件。陈峰：监督，概念构思。曹月：撰写——初稿，监督，资金获取，概念构思。

未引用参考文献

Brüggemann, Meder and Freitag, 1996

Hassan, 2023

Kitagawa, 2014

Stijve and Seeger, n.d

Xamena, Abad, Corma and Garcia, 2007

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（21904068、21906019和81922041）、江苏省科技支持计划（BK20201351）、南京医科大学特聘教授计划及人才引进研究启动基金（NMUR2019007）、中国司法部上海法医学重点实验室（法医学科学院开放课题（KF202006）以及春晖教育基金会的支持。