GH51阿拉伯呋喃糖苷酶Cabf51的特性鉴定与结构分析：该酶催化人参皂苷Rc和化合物MC1转化为人参皂苷Rd和人参皂苷F2的过程

《International Journal of Biological Macromolecules》：Characterization and structural analysis of a GH51 arabinofuranosidase Cabf51 catalyzing the transformation of ginsenoside Rc and compound MC1 into ginsenoside Rd and ginsenoside F2

该研究克隆并表达了 Cellulosimicrobium sp. TH-20来源的GH51家族ABF酶Cabf51，发现其pH 7.0和60℃下对G-Rc及C-Mc1具有特异性水解活性，生成G-Rd和G-F2。结构分析揭示半开放沟槽与Trp178、Lys309等关键残基形成动态门控机制，Asn72通过氢键网络稳定底物，抑制大分子ginsenosides进入。该成果为设计高效酶工程提供了结构-功能新视角。

　　

周一凯|孙敖|徐明昊|王思旭|周浩|陈贤兰|王金豪|李凡|赵大庆|余珊珊

中国吉林省长春市长春中医药大学附属医院

摘要

本研究重组表达了来自Cellulosimicrobium sp. TH-20的GH51 α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶（Cabf51），并对其进行了表征和功能分析。Cabf51在pH 7.0和60°C条件下表现出最佳活性，并且通过阿拉伯呋喃糖的诱导而激活。该重组酶能够选择性地水解人参皂苷Rc（G-Rc）和化合物Mc1（C-Mc1）中C-20位置的阿拉伯呋喃糖基，分别生成人参皂苷Rd（G-Rd）和G-F2（G-F2）。Cabf51对

NP-Araf

、C-Mc1和G-Rc的k_cat/K_m值分别为102.32、27.49和14.75 s^?1 mM^?1。Cabf51-配体复合物的结构分析揭示了GH51阿拉伯呋喃糖苷酶对人参皂苷的新颖底物选择性机制。Cabf51的三维结构显示存在一个从蛋白质表面向内部逐渐变窄的半开放沟槽。门控残基（Trp178和Lys309）是底物结合的关键决定因素。Cabf51催化通道的层次结构起到了几何驱动的选择性过滤器作用，狭窄的结合口袋阻止了较大人参皂苷的进入。这一独特的结构特征使得Cabf51能够招募Asn72作为辅助催化残基。Asn72固定了G-Rc或C-Mc1并稳定了氢键网络，从而有效地推动了水解过程的完成。这些发现增强了我们对GH51家族阿拉伯呋喃糖苷酶催化机制的理解，并为开发更高效、多用途的酶以加速人参皂苷生物转化提供了理论基础。

引言

人参皂苷是五加科植物（如人参和三七）的主要生物活性成分。G-Rc和C-Mc1分别占人参茎叶提取物中总皂苷的约13.81%和15.7% [1]。G-Rc具有治疗糖尿病[2]、改善心血管和神经保护功能[3]以及预防和治疗癌症[4]的作用。C-Mc1在缓解非酒精性脂肪肝方面显示出潜力，其机制是通过减轻内质网应激[1]以及通过AMPK依赖途径减少心肌氧化应激和细胞凋亡[5]。G-Rc和C-Mc1的结构由一个达玛烷型四环三萜核和侧链上的糖基团组成。在C-20位置，这两种化合物都携带一个末端非还原性的α-l-阿拉伯呋喃糖基，通过α-(1→6)-糖苷键连接[6]。它们的主要结构差异在于C-3位置：G-Rc含有两个葡萄糖吡喃基团（3-O-β-d-葡萄糖吡喃基-(1→2)-β-d-葡萄糖吡喃基），而C-Mc1仅在C-3位置含有一个葡萄糖基团。

糖基团显著影响了皂苷的整体性质和生物效应。糖基团的类型、数量和连接位置对皂苷的多种特性（包括溶解度、膜通透性和与细胞靶点的相互作用）都有影响[7]。Jeon等人报告称，G-Rd的粪便回收率超过了口服剂量的291%，远高于G-Rc的37.3%，G-Rd是通过G-Rc的脱糖作用产生的，具体是通过去除C-20位置的阿拉伯呋喃糖基[8]。Ali等人报告称，G-Rh2的ACE抑制活性是G-Rc的178.4倍；G-Rh2是通过C-20和C-3位置的糖基团脱糖作用从G-Rc转化而来的[9]。Li等人表明，脱糖代谢物PPD在前列腺癌细胞中诱导了44%的细胞凋亡，这一效果大约是G-Rc的133倍[10]。因此，脱糖修饰已成为获得潜在药物候选物的有效策略，不仅增强了其药理活性，还扩展了其在疾病治疗中的应用范围。

阿拉伯呋喃糖苷酶（ABFs）是一类能够特异性水解非还原性末端α-l-阿拉伯呋喃糖基的酶，广泛存在于细菌[11]、真菌[12]和植物[13]中。G-Rc和C-Mc1的结构分析表明，脱糖作用是通过其侧链中的糖苷键（特别是C-3位置的糖苷键和C-20位置的阿拉伯呋喃糖键）的水解来进行的。目前的研究主要集中在C-3糖苷键的水解上；例如，来自Armillaria mellea、Sulfolobus solfataricus和Aspergillus niger NG1306的β-葡萄糖苷酶能够将G-Rc水解为C-Mc1 [14],[15]。相比之下，只有少数ABFs（如来自Thermotoga thermarum DSM5069 [16]和Caldicellulosiruptor saccharolyticus [8]）被报道能够选择性切割G-Rc的C-20阿拉伯呋喃糖键，生成G-Rd。此外，关于转化人参皂苷的阿拉伯呋喃糖苷酶的研究主要集中在酶的克隆、纯化和活性分析上，而对催化机制（尤其是底物识别的结构决定因素）的研究相对较少。对参与人参皂苷转化的ABFs进行系统的结构-功能研究可以阐明其活性、催化机制和底物选择性的分子决定因素。

计算方法对于阐明参与人参皂苷转化的糖苷水解酶的底物特异性越来越重要。例如，Liu等人利用分子对接技术研究了β-葡萄糖苷酶与多种底物（包括G-Rb1、G-Rd和Gyp XVII）的结合亲和力，从而揭示了结合构象与催化效率之间的关系。该研究还探讨了疏水性氨基酸对结合能的调节作用，突变实验表明去除关键残基会使酶活性降低28% [17]。类似地，Lin等人结合分子动力学（MD）模拟和分子对接技术分析了β-葡萄糖苷酶在催化G-Rg1和NG-R1过程中的活性位点空间阻碍，通过减少空间阻碍和加强氢键网络，他们将针对G-Rg1和NG-R1的催化效率分别提高了13.88倍和108.56倍 [18]。根据CAZy数据库，只有七种来自GH51家族的细菌来源的ABFs具有已解析的蛋白质结构，其中只有来自Rhodanobacter ginsenosidimutans的ABF被报道能够水解G-Rc。然而，关于GH51 ABFs在人参皂苷水解中的分子机制和底物选择性的研究仍然有限。结构-功能关系中的关键方面，包括关键残基在底物识别中的作用、结合口袋的动态适应以及催化能量的变化，尚未得到充分阐明。

本研究从Cellulosimicrobium sp. TH-20中克隆了一种新的GH51 ABF，并进行了异源表达，进一步通过高效液相色谱（HPLC）评估了其酶学性质。通过分子对接、MD模拟和定向突变研究了Cabf51对

NP-Araf

、C-Mc1和G-Rc的催化机制和底物选择性。这些结构-功能研究为设计多功能ABFs提供了坚实的理论基础，从而加速了复杂人参皂苷的可持续生物转化。

材料

G-Rc、G-Rd、C-Mc1和G-F2的标准品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。

-硝基酚系列的底物购自Yuanye（中国上海）。有机溶剂来自北京化工厂（中国北京）。IPTG和卡那霉素购自上海Yuanye生物技术有限公司（中国上海）。所有克隆酶（包括限制性内切酶）均来自Takara Biotech（日本）。点突变的引物也来自

Cabf51的序列分析

1521 bp的Cabf51基因（GenBank: WP_085388508.1）来自Cellulosimicrobium sp. TH-20，编码一个507个氨基酸的蛋白质。InterPro结构域分析确认了其属于GH51阿拉伯呋喃糖苷酶家族。BLAST分析显示，Cabf51与Microbacterium sp. cf332、Microbacterium plantarum和Cryobacterium zhongshanensis中的ABFs的氨基酸序列同源性分别为66.63%、66.53%和65.49%。

讨论

从Cellulosimicrobe sp. TH-20中克隆出了一种新的GH51阿拉伯呋喃糖苷酶（Cabf51），并进行了异源表达和酶学表征。Cabf51表现出广泛的底物选择性，能够高效水解合成底物（如

NP-α-l-Araf、

NP-β-d-Xyl、

NP-β-d-Gal、

NP-α-l-Arap、

NP-β-d-GlcA）以及天然底物（包括G-Rc和C-Mc1）。此外，它还具有耐热性和在较宽的pH范围（pH 5.0–10.0）内的显著稳定性。

结论

从Cellulosimicrobium sp. TH-20中分离出的Cabf51代表了GH51家族的新成员，表现出pH耐受性和广泛的底物选择性，以及产物逆向激活的特性。此外，它还能选择性地高效催化人参皂苷G-Rc和C-Mc1的C-20侧链阿拉伯呋喃糖苷键，生成G-Rd和G-F₂。我们发现Trp178和Lys309形成了一个动态的门控机制，这使得人参皂苷难以

CRediT作者贡献声明

周一凯：撰写——初稿、方法学、数据分析。孙敖：撰写——初稿、概念构思。徐明昊：实验研究。王思旭：方法学。周浩：实验研究。陈贤兰：实验研究。王金豪：方法学。李凡：撰写——审稿与编辑、实验研究。赵大庆：指导。余珊珊：指导、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者确认本研究中不存在任何财务或个人利益冲突。

致谢

本工作得到了吉林省科技发展计划项目（项目编号：YDZJ202401424ZYTS）的支持。