《International Journal of Biological Macromolecules》：Sustainable ethyl cellulose fibrous films with nitrogen-carbon dots for fresh-cut apple preservation
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通过系统修饰ZrBTB，胺基化ZrBTB-NH2展现出最高酶负载量，并显著提升催化活性和稳定性，适用于宽pH（2-8）和极端条件（25-90°C）。
Fan Yang| XuanJing|Yifan Chen|Li-wen Wang|Zhong Wang|Xiaomin Hou|Si-Fu Tang
中国山东省微生物资源探索与创新利用重点实验室，青岛农业大学生命科学学院，青岛，266109
摘要
将酶固定到金属有机框架（MOFs）上是一种提高生物催化稳定性和可重复使用性的有效策略，然而在保持酶活性的同时实现高负载能力仍然具有挑战性。在这里，我们报道了一种基于锆的功能化MOFs（ZrBTB-X）的合理设计，用于高效固定细胞色素c（Cyt c）。通过系统地用不同的功能基团修饰ZrBTB，我们发现胺功能化的ZrBTB-NH2不仅具有最高的酶负载能力，而且与游离的Cyt c相比显著提高了催化活性和稳定性。值得注意的是，Cyt c@ZrBTB-NH2复合材料在广泛的pH范围内（2–8）保持高活性，并且在极端条件下（如高温25–90?°C和非生理环境中）表现出优异的稳定性。实验和理论研究表明，其性能的提升源于优化的酶-MOF相互作用，包括高比表面积、增强的氢键作用和静电互补性。这项工作不仅提供了一种高效的酶固定方法，还阐明了MOF表面工程在调节酶-MOF亲和力和催化性能中的关键作用，为先进生物催化系统的设计提供了宝贵的见解。
引言
由于酶具有出色的催化效率、底物特异性以及在温和反应条件下的操作能力，因此在工业上受到了广泛关注[1]，[2]。然而，它们的广泛应用受到内在限制的制约，包括在恶劣操作条件（高温、极端pH值或有机溶剂）下的稳定性较差，以及回收和再利用方面的挑战[3]，[4]，[5]。为了克服这些缺点，将酶固定到固体载体上（如多孔碳、聚合物和金属有机框架（MOFs）已成为一种有效的策略[6]，[7]，[8]。这种方法不仅提高了酶在非生理环境下的稳定性，并提供了有利的微环境[9]，还便于回收和重复使用，从而改善了工艺经济性并实现了连续操作[10]，[11]。此外，固定化通常简化了下游产品分离并降低了污染风险[12]，[13]，[14]，[15]。然而，酶固定化也并非没有局限性。潜在的缺点包括由于构象变化或空间位阻导致的部分催化活性损失、可能降低反应速率的扩散限制、载体制备的复杂性和成本增加，以及在某些条件下酶的泄漏可能性[16]。因此，选择合适的载体材料和固定化方法对于平衡活性保留、稳定性提升以及工业规模化的整体可行性至关重要。
MOFs是一种由金属节点和有机连接剂构成的结晶多孔材料，由于其超高的比表面积、可调的孔隙几何结构和模块化的化学功能而特别适合作为酶固定基质[17]，[18]，[19]，[20]。酶可以通过多种策略结合到MOFs中，包括物理吸附、共价结合和共沉淀。其中，物理吸附因其操作简便、条件温和且对酶构象的干扰最小而备受青睐，是一种广泛应用且多功能的方法。尽管存在负载效率中等和酶可能泄漏等挑战[21]，[22]，[23]，但这些通常可以通过仔细优化MOF表面性质和吸附条件来缓解[24]，[25]。相比之下，共价结合可以提高稳定性，但可能会降低酶活性；而共沉淀可以改善酶的约束效果，但也可能限制底物的扩散[6]，[26]，[27]。因此，开发物理吸附的酶-MOF系统仍然是实现高负载、保持活性和操作稳定性的一个有前景的方向——这解决了开发稳健固定化生物催化剂的关键问题。
MOFs的酶吸附能力受两个关键因素的影响：（1）微观结构特性（孔径大小和表面积）和（2）酶-MOF之间的相互作用强度[23]。为了扩大孔径，可以通过网状化学策略使用延长的有机连接剂[28]，[29]。例如，用H3TATB替换PCN-333中的H3BTTC可以产生比PCN-332更大的孔腔，从而实现前所未有的酶负载量[30]。然而，过度的连接剂延长可能会由于互穿或合成挑战而影响框架的稳定性[31]，[32]，[33]。此外，考虑到典型MOF孔径（约1–3?nm）与酶（大于5?nm）之间的尺寸不匹配，仅靠孔径扩张往往不足以实现最佳固定效果。
另一种方法是通过定制的界面相互作用来增强酶-MOF的亲和力，包括静电作用、氢键作用、π-π堆叠和范德华接触[34]。值得注意的是，范德华作用在吸附能量中占主导地位[35]，并且与固定稳定性直接相关[36]。通过用极性或带电基团（例如，?OH，?NH2）对MOF连接剂进行战略性功能化，可以增强这些相互作用，同时调节表面疏水性和与目标酶的静电互补性[37]。最近的研究强调了功能化MOFs在酶固定方面的潜力。例如：固定在MCIL@Cu-UiO-66-NH2上的漆酶表现出高的活性恢复率和稳定性[38]；PEI交联的NH2-MOF-5使固定的Pseudomonas fluorescens脂肪酶的活性提高了两倍，并且在8个循环后仍保持超过80%的活性[39]；脯氨酸修饰的UiO-66-NH/Pro提高了Candida rugosa脂肪酶在水解反应中的活性和对映选择性[40]。我们最近的工作开发了一系列用不同基团功能化的UiO-66衍生物，用于过氧化氢酶（CAT）和细胞色素c的固定[41]。羟基功能化的UiO-66（UiO-66-OH）表现优于其他变体，这归因于其最佳的界面化学性质和增强的酶亲和力。
尽管取得了这些进展，但关于特定功能基团如何影响酶负载、稳定性和催化性能的系统研究仍然较少。基于这些见解，我们使用了另一种基于锆的ZrBTB——具有优异的稳定性和高孔隙率（椭圆形孔径：7.16?×?12.61??；通道：14.37?×?14.37??）[42]——作为一个模块化平台来探索酶固定中的结构-性能关系。合成了一系列用不同功能基团功能化的ZrBTB衍生物，并评估了它们对细胞色素c的固定效果。胺功能化的ZrBTB-NH2表现出出色的负载能力、催化增强和操作稳定性。结合实验和理论计算表明，其优异的性能可能是由于优化的酶-MOF相互作用和微环境效应。除了实际的固定指标外，这项工作还阐明了控制酶在MOFs上吸附的基本相互作用及其对生物催化性能的影响。
ZrBTB系列MOFs的合成
ZrBTB及其衍生物（ZrBTB-X）是通过改进的溶热法从1,3,5-三(4-羧基苯基)苯（H3BTB）及其衍生物（方案S1）合成的，基于之前报道的程序[43]，[44]。制备的MOFs分别表示为ZrBTB和ZrBTB-X（X?=?OH，NH2，CH3和Py）。详细的合成和活化程序见支持信息。
Cyt c@ZrBTB和Cyt c@ZrBTB-X的制备
ZrBTB系列MOFs（100?mg），包括ZrBTB及其功能化衍生物
ZrBTB系列MOFs和Cyt c@MOF复合材料的表征
通过XRD图谱（图1a和S1）确认了合成的ZrBTB系列MOFs的相纯度。细胞色素c加载后，衍射峰与模拟图谱一致，表明晶体框架得到了保留。此外，FT-IR光谱证实了细胞色素c的固定，通过独特的光谱特征进行了验证。在约1653?cm
?1处出现了一个新的峰（图1b和S2），对应于酰胺I C
O伸缩振动，这反映了
结论
在这项研究中，系统地探索了一系列功能化的ZrBTB型MOFs作为细胞色素c的固定基质。所得到的Cyt c@MOF复合材料通过FT-IR、XRD、SEM、N2吸附/脱附、TGA、CLSM和ζ电位测量进行了全面表征。我们的结果表明，引入的功能基团在决定MOFs的形态、表面积和表面电荷（ζ电位）方面起着关键作用，这些因素又进一步影响了
CRediT作者贡献声明
Fan Yang：方法学、研究、数据分析。XuanJing：研究、数据分析。Yifan Chen：验证、研究、数据分析。Li-wen Wang：研究、数据分析。Zhong Wang：资源获取、数据分析。Xiaomin Hou：撰写初稿、监督、资源获取、方法学、资金获取、概念构思。Si-Fu Tang：撰写和编辑、监督、资源获取、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32170172）和山东省自然科学基金（编号：ZR2024MC111、ZR2024MB048）的支持。
