《International Journal of Biological Macromolecules》：Reticuline isomerase AKR1B1 with aldo-keto reductase activity and detoxification function from the insect
Blaps rhynchopetera
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鉴定蜣螂中新型醛酮还原酶AKR1B1并证实其催化(S)-reticuline向(R)-reticuline异构化功能，发现其对杀虫剂解毒的作用，并揭示其在成虫及中肠组织的特异性表达。该成果为开发昆虫源多功能酶及药物靶点提供新依据。
张兰梅|周胜文|杨希哲|詹姆斯·姆旺吉|曹凯迅|张成晨|孟萍|王子怡|赵敏|史磊|卢秋敏
中国林业科学院高原森林科学研究所，国家林业和草原管理局资源昆虫培育与利用重点实验室，云南，650224
摘要
当食草昆虫暴露于小分子化合物（如生物碱）时，它们进化出了双重适应策略。它们可以利用某些化合物来支持生长发育，同时通过内源性酶解毒有害物质。多种酶参与这些过程，包括醛酮还原酶（AKRs）和细胞色素P450酶。目前，已知只有植物中存在产生网纹碱的异构酶，尚未在动物或昆虫中发现其存在。基于Blaps rhynchopetera的转录组，我们发现了一种具有多种生物学功能的新醛酮还原酶AKR1B1。本研究表明，AKR1B1在体外可以催化(S-网纹碱转化为(R-网纹碱)，这表明它同时具有醛酮还原酶和异构酶的双重作用。虚拟筛选发现替阿普芬酸和吡哌米酸是小分子抑制剂，能有效抑制AKR1B1对(S-网纹碱的催化活性。基于抗体的定位实验显示，AKR1B1在成虫和中肠组织中的表达水平最高，而在卵和肌肉组织中的表达量最低。此外，杀虫剂诱导实验证实了AKR1B1在B. rhynchopetera中的解毒作用。这些发现表明AKR1B1在昆虫化合物代谢和解毒中起着关键作用。这一发现为开发昆虫来源的双功能酶提供了新的靶点，有助于药物开发和解毒研究，同时也深入揭示了昆虫的生理机制。
引言
在长期的进化过程中，食草昆虫不断接触各种外源化合物，包括植物次生代谢产物（如生物碱）和人为污染物（如合成杀虫剂）。这种持续的化学生态压力促使昆虫进化出了多层次的适应防御机制，包括行为回避、生理屏障的结构强化、靶点抗性的发展以及代谢解毒途径的激活[1]。在这些机制中，由醛酮还原酶（AKRs）、细胞色素P450单加氧酶（CYP450s）和羧酸酯酶（COEs）等酶介导的代谢解毒是最普遍的解毒方式[2]，[3]。值得注意的是，昆虫针对这些化合物进化出了双重代谢策略：一些小分子代谢产物通过专门途径被吸收为营养资源，而细胞毒性物质则通过酶依赖的生化反应被解毒[4]。这些适应性特征为解读昆虫对环境压力的反应提供了宝贵的模型。
醛酮还原酶超家族（AKRs）包含超过190个成员，广泛分布于原核生物和真核生物中，包括真菌、植物、昆虫和人类[5]。AKRs主要以34–37 kDa的单体可溶性蛋白质形式存在，其特征是相同的蛋白质折叠结构——三磷酸甘油醛异构酶或(α/β) 8桶状结构[6]。AKRs利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作为辅因子催化氧化还原反应，参与多种生理过程[7]，并且具有广泛的底物特异性。它们既能催化醛类、酮类、单糖、酮甾醇和前列腺素的还原，也能催化羟基甾醇的跨二羟基化合物和多环芳烃的氧化[8]。
根据氨基酸序列多样性和底物特异性，AKR超家族被分为16个家族（AKR1-AKR16）。每个家族进一步分为多个亚家族，包括羟基甾醇脱氢酶、前列腺素合成酶、外源物质解毒酶和醛类还原酶[7]。其中，含有醛酮还原酶的AKR1B亚家族已被广泛研究，其在各种生物体中都有分布[9]。在昆虫中，AKRs在应激适应中起着关键作用。例如，在滞育期间，它们的表达增加，有助于产生渗透调节物质（如山梨醇），从而在不利条件下维持生存[10]。值得注意的是，蚕中的醛酮还原酶AKR2E9可以参与桑叶中醛类的解毒[11]。总之，这些发现突显了AKR在应激反应和代谢解毒中的关键作用。
代谢解毒途径，特别是涉及CYP450s的途径，对昆虫适应植物植物化学物质和合成杀虫剂至关重要[15]，[16]。CYP450s的遗传多样性和广泛的底物特异性使它们能够代谢内源性和外源性外来物质，其诱导或组成型过表达是杀虫剂抗性的关键机制[17]，[18]。尽管CYP450s和COEs在昆虫解毒研究中得到了广泛研究，但AKRs在介导植物来源生物活性化合物代谢中的功能作用仍需进一步探索，尤其是在药用昆虫等特殊昆虫谱系中。
网纹碱是一种具有显著药理活性的生物碱，具有抗炎、免疫调节和神经保护作用[14]。其正异构体(S-网纹碱)是超过2500种苄基异喹啉生物碱的共同生物合成前体[15]。先前的研究表明，植物中的AKR酶可能参与此类立体特异性还原反应[16]。在生物合成过程中，该化合物通过酶促转化为其药理活性形式(R-网纹碱)[17]。立体化学转化通过两步酶促过程完成：首先(S-网纹碱被氧化为1,2-脱氢网纹碱，然后通过NADPH依赖的还原生成(R-网纹碱)[15]，[18]。值得注意的是，催化这种转化的异构酶仅在植物中被发现，尚未在动物或昆虫系统中报道。然而，目前尚不清楚昆虫中是否存在类似的酶系统来催化网纹碱的立体化学转化。鉴于AKR超家族酶在催化羰基化合物转化中的广泛功能，我们提出假设昆虫可能通过特定的AKR成员实现网纹碱的异构化。
B. rhynchopetera在云南少数民族的传统医药实践中被用作治疗性昆虫资源[19]，[20]。尽管其药用价值已初步得到证实，但其活性成分及其作用机制的研究仍处于初级阶段。为了探索该酶在B. rhynchopetera中的潜在生物学意义，我们发现它在其中肠组织中高度表达。鉴于中肠是外源毒素摄入和初级代谢的关键部位，我们进一步假设AKR可能参与了昆虫的解毒防御机制。为了验证这些假设，我们首次在B. rhynchopetera中鉴定并表征了一种新的醛酮还原酶AKR1B1。我们在体外证明AKR1B1可以催化(S-网纹碱转化为(R-网纹碱)，并参与杀虫剂的解毒。这项工作将AKR1B1确定为开发昆虫来源的双功能酶的有希望的靶点，具有在药物发现和害虫抗性管理中的潜在应用。
实验部分
RNA提取
从中国云南省元谋县（N26°02.698′, E101°56.865′, 1895 m）收集了B. rhynchopetera的成虫、蛹和幼虫。根据制造商说明书（Invitrogen, USA），将成虫、蛹和幼虫置于液氮中并使用Trizol试剂进行提取。使用Nanodrop仪器（Thermo Scientific, USA）测定浓度和纯度。琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，并通过...
通过差异基因筛选和系统发育分析发现了B. rhynchopetera的醛酮还原酶基因
对B. rhynchopetera的不同龄期的RNA（包括幼虫、蛹和成虫）进行RNA-Seq分析，通过差异表达分析识别醛酮还原酶的候选基因。令人鼓舞的是，幼虫、蛹和成虫的差异基因成对进行了比较。火山图显示共筛选出5个醛酮还原酶基因，其中两个基因显著上调（图1）。对这些基因进行了系统发育分析...
讨论
AKRs是一类依赖NADPH的氧化还原酶超家族，它们在原核生物和真核生物的生理过程中催化关键反应。这主要归因于它们能够代谢各种含羰基的化合物，以及它们对微生物压力的解毒和响应[44]，[45]，[46]。然而，许多AKR超家族成员在昆虫中尚未得到充分研究。迄今为止，在昆虫中发现的AKRs包括家蚕Bombyx mori L.中的AKR2E4...
CRediT作者贡献声明
张兰梅：撰写——原始草稿、可视化、软件、方法学、数据分析。周胜文：撰写——审阅与编辑、软件。杨希哲：软件、数据分析。詹姆斯·姆旺吉：撰写——审阅与编辑。曹凯迅：数据分析。张成晨：软件。孟萍：撰写——审阅与编辑。王子怡：撰写——审阅与编辑。赵敏：撰写——审阅与编辑、项目管理、概念构思。史磊：撰写——审阅与编辑、项目...资助
作者衷心感谢以下机构的财政支持：中国科学技术部（2025YFA1308900 和 2023YFF1304900）、国家自然科学基金（32530016 和 92469103）、中国科学院（SAJC202402 和 YSBR-111）、云南省科学技术厅（202305AH340007 和 202449CE340005）、云南省人才振兴支持计划（YNWR-CYJS-2020-008）、昆明市...
致谢
我们衷心感谢中国科学院昆明动物研究所（KIZ）的机构技术与设施共享中心提供的质谱分析支持，以及广州Yinfo信息技术有限公司（中国广州）提供的虚拟筛选分析支持。同时，我们也感谢林增的技术支持。
