《International Journal of Biological Macromolecules》：HSP70 preserves brain microvascular endothelial integrity under heat stress associated with suppressed JNK-mediated apoptosis and mitophagy
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本研究通过鸡、小鼠及bEnd.3细胞模型，揭示热应激通过激活JNK通路引发内皮细胞凋亡和mitophagy，同时上调HSP70表达。实验证实HSP70通过抑制JNK减轻氧化损伤及线粒体凋亡，从而保护血脑屏障。为应对热应激相关脑损伤提供了新机制。
周梦琳|李海生|万美琳|纪泽平|刘志豪|万中玲|蔡家伟|史家晨|邱新军|张晓辉
海南大学热带农业与林业学院（农业与农村事务学院，农村振兴学院），海口，570228，中国
摘要
热应激会严重破坏牲畜和人类的血脑屏障（BBB）完整性和大脑稳态；然而，其背后的分子机制仍不甚明了。在这项研究中，我们使用了体内模型（鸡和小鼠）和体外脑微血管内皮细胞模型（bEnd.3细胞）来阐明热应激诱导的内皮损伤机制。研究结果表明，热应激导致了明显的血管周围水肿和内皮氧化损伤，下调了紧密连接蛋白，并损害了屏障功能。热应激还引发了严重的线粒体结构损伤，促进了线粒体分裂，并触发了c-Jun N末端激酶（JNK）信号的持续激活，进而导致caspase依赖性凋亡和PTEN诱导的假定的激酶1（PINK1）/Parkin RBR E3泛素蛋白连接酶（Parkin）介导的线粒体自噬。3-甲基腺嘌呤和mdivi-1的药理干预表明，热应激诱导的自噬和线粒体自噬反而加剧了内皮细胞损伤，而非提供细胞保护。此外，热应激显著增加了脑组织和内皮细胞中的热休克蛋白70（HSP70）表达。通过HSP70过表达和敲低的功能研究，以及JNK的化学激活和抑制，发现HSP70通过抑制JNK激活来减轻热应激诱导的内皮氧化损伤、线粒体凋亡和线粒体自噬，从而保持了BBB的完整性。最后，共免疫沉淀和免疫荧光分析证实了HSP70与JNK之间的相互作用。总体而言，这项研究加深了我们对热应激诱导的BBB功能障碍的理解，并确定了HSP70介导的JNK调控作用作为潜在的治疗干预手段，对于减少家禽因热应激导致的死亡和缓解人类中暑引起的中枢神经系统损伤具有重要意义。
引言
全球变暖和日益频繁的热浪显著增加了动物热应激的普遍性[1]。热应激不仅影响动物福利，还对全球动物生产造成了巨大的经济负担。例如，在2021年的太平洋西北部热浪期间，有超过65万只农场动物死亡，这凸显了热应激对动物生存和生产的严重影响[2]。脑损伤越来越被认为是跨物种热应激诱导死亡的关键因素[3]，[4]，因此阐明热应激导致脑损伤的机制对于制定有效的动物和人类健康保护策略至关重要。
热应激引起的脑损伤涉及组织层面的多种病理过程，包括脑灌注不足、神经炎症、脑水肿和周围免疫细胞的浸润[4]，[5]，[6]。血脑屏障（BBB）的破坏被认为是热应激诱导脑损伤的最早和最关键的事件[6]，[7]，因为BBB是调节分子交换并限制循环系统向神经组织渗透的主要界面[8]，[9]。在这个屏障中，脑微血管内皮细胞（BMECs）通过形成由紧密连接封闭的连续内皮层直接限制细胞旁通透性[8]，[9]。BMECs对热应激的敏感性源于它们位于血脑界面的独特位置，使它们暴露于循环中的应激因子，以及它们本身较高的代谢需求[10]。热应激引起的血管内皮功能障碍伴随着过量的活性氧（ROS）生成、线粒体功能障碍以及不适应的细胞反应，如凋亡和自噬[11]，[12]，[13]，[14]。然而，这些过程之间的关系以及它们如何最终导致紧密连接蛋白的丢失和BBB的破坏仍不甚清楚。
线粒体是细胞中的核心枢纽，协调细胞能量代谢、氧化还原平衡和细胞命运决定；因此，它们的结构和功能完整性对于维持细胞稳态和生存至关重要[15]。多种病理和应激模型表明，线粒体功能障碍伴随着过量的ROS积累，可以触发凋亡和线粒体自噬[16]，[17]，[18]。线粒体自噬是一种特殊的自噬形式，通过选择性地清除受损或去极化的线粒体来保护细胞，从而防止过量的ROS和促凋亡信号的积累[19]，[20]。这一过程受到关键分子途径的严格调控，包括PINK1/Parkin轴；涉及BNIP3和NIX的受体介导机制；以及与核心自噬蛋白（如LC3、Beclin-1和p62）的相互作用[15]，[19]。然而，如果线粒体自噬不足或失调，受损的线粒体可能会释放细胞色素c，激活caspase依赖性的凋亡级联反应[15]，[19]。因此，线粒体自噬和凋亡之间的动态平衡是热应激期间内皮细胞命运的关键决定因素，阐明这种相互作用对于理解热应激引起的BBB破坏至关重要。
热休克蛋白（HSPs）是一类高度保守的分子伴侣蛋白，它们通过促进新生多肽的正确折叠、重新折叠变性的蛋白质，并将错误折叠的蛋白质靶向通过泛素-蛋白酶体和自噬-溶酶体途径进行降解，从而在生理和应激条件下帮助维持蛋白质稳态[21]，[22]，[23]。HSPs还调节与凋亡、线粒体自噬、炎症和氧化还原平衡相关的关键信号通路，从而在应激暴露期间有助于细胞存活[23]，[24]，[25]。HSP70是HSP家族中最易诱导和功能最多样化的成员之一，在应对各种病理生理应激时迅速上调[22]，[23]。JNK通路是连接HSP70功能与细胞应激反应调节的重要桥梁，其在细胞保护中的作用已得到广泛研究[26]，[27]，[28]。因此，HSP70–JNK相互作用可能是热应激期间BMECs脆弱性的重要决定因素。
在这项研究中，我们旨在探讨热应激如何损害BMEC功能的细胞和分子机制，特别关注HSP70的调节作用。为了具有广泛的物种相关性（包括牲畜）、哺乳动物验证和机制表征，我们使用了文昌鸡、昆明小鼠和bEnd.3内皮细胞，在热诱导的脑血管损伤模型中进行研究。我们假设热应激主要通过JNK依赖的凋亡和线粒体自噬来损害脑微血管内皮的完整性，并且HSP70是一种内在的保护因素，可以限制JNK的激活。通过阐明HSP70–JNK信号对热应激下内皮细胞命运的影响，这项研究加深了我们对热诱导的脑血管损伤的理解，并为兽医和人类医学中的保护策略开发提供了依据。
部分摘录
动物处理
共获得了34只74日龄的雄性文昌鸡（725±25克），来自中国文昌的龙泉文昌鸡业有限公司。在标准饲养条件下（22±2°C，50±10%相对湿度（RH），12小时光照/12小时黑暗周期）适应7天后，随机选择了24只鸡在JC-1000-GSIE人工气候室（中国景城仪器公司）中暴露于42±1°C和65% RH的热应激下
热应激导致脑血管结构破坏、氧化损伤和内皮功能障碍
使用体内动物模型和体外bEnd.3内皮细胞全面评估了热应激引起的脑血管变化，重点关注组织病理变化、氧化应激和屏障完整性。苏木精和伊红（H&E）染色显示，热应激在两种体内模型中均引起了明显的脑组织结构异常。HSS组中的文昌鸡表现出轻微的血管扩张和血管周围组织松弛。讨论
热应激可以破坏血脑屏障（BBB），这是中枢神经系统损伤的关键机制[4]，[6]。我们的体内和体外结果表明，急性热应激会导致BBB损伤，表现为紧密连接蛋白水平（ZO-1和Claudin-5）下降、细胞旁通透性增加以及伴随的内皮细胞损伤和ROS积累。来自局部脑热研究的证据表明，热应激直接增加了BBB的通透性
CRediT作者贡献声明
周梦琳：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。李海生：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。万美琳：验证、方法学、研究。纪泽平：资源提供、方法学、研究。刘志豪：资源提供、方法学、研究。万中玲：资源提供、方法学、研究。蔡家伟：资源提供
伦理批准
所有实验程序均获得了海南大学机构动物护理和使用委员会（HNUAUCC-2022-00084）的批准。所有处理均以人道的方式进行，尽一切努力减少动物的痛苦。
写作过程中声明生成式AI和AI辅助技术的使用
在准备这项工作期间，作者没有使用任何AI和AI辅助技术。财务支持声明
这项工作得到了国家自然科学基金（32260868和32472980）、海南省重点研发项目（ZDYF2024XDNY218和ZDYF2024SHFZ050）以及海南大学科研启动基金（KYQD(ZR)-22006和RZ2300002834）的支持。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
