EuPPPDE8是一种泛素化酶，通过与Eucommia ulmoides中的EuFPS1和EuMGRN1相互作用来促进橡胶的生物合成

《International Journal of Biological Macromolecules》：EuPPPDE8, a deubiquitinating enzyme, promotes rubber biosynthesis by interacting with EuFPS1 and EuMGRN1 in Eucommia ulmoides

欧亚脂材树（Eucommia ulmoides）PPPDE家族成员系统鉴定及EuPPPDE8在橡胶合成中的调控机制研究。通过基因组分析鉴定9个PPPDE家族成员，发现EuPPPDE8与关键酶EuFPS1相互作用，低温下表达下调导致FPS活性及橡胶含量显著降低。过表达EuPPPDE8使橡胶含量提升51.51%，沉默则降至野型的0.82倍，证实其通过去泛素化调控橡胶合成。

　　

Huaijuan Jiao|Dan Zhao|Xi Chen|Ying Zhu|Yichen Zhao|De-gang Zhao

中国贵州省贵阳市贵州大学生命科学学院/茶科学学院，教育部山地植物资源保护与种质创新重点实验室，邮编550025

摘要

含有肽酶结构域的酶（PPPDE）基因家族在植物生长发育、应激反应和信号转导中起着关键作用。在先前研究的基础上，该研究鉴定出一种去泛素化酶作为Eucommia ulmoides法尼基焦磷酸合成酶1（EuFPS1）的相互作用蛋白，而EuFPS1是Eucommia ulmoides橡胶生物合成的关键酶。本研究系统地从Eucommia ulmoides基因组中鉴定出9个编码去泛素化异肽酶的PPPDE家族成员，这些酶具有C97肽酶结构域。通过对包括Eucommia ulmoides在内的5个物种中的86个PPPDE和类似PPPDE的蛋白质进行共线性及系统发育关系分析，发现这些蛋白质在产胶植物中具有高度同源性。研究人员克隆了编码与EuFPS1相互作用的蛋白Eucommia ulmoides肽酶结构域含有酶8（EuPPPDE8）的基因。酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）实验证实了EuFPS1与EuPPPDE8之间的相互作用。研究发现，在低温条件下，EuPPPDE8的表达下调，同时Eucommia ulmoides中的法尼基焦磷酸合成酶活性和橡胶含量也显著降低。利用EuPPPDE8作为诱饵，筛选出23个潜在的相互作用蛋白，其中包括Eucommia ulmoides mahogunin环指蛋白1（EuMGRN1），实验进一步确认了它们之间的相互作用。EuPPPDE8定位于细胞质中。推测EuPPPDE8可能通过其去泛素化活性参与EuMGRN1介导的蛋白质降解途径，从而拮抗EuMGRN1调控的蛋白质降解过程。通过过表达和沉默EuPPPDE8基因，发现过表达EuPPPDE8可使Eucommia橡胶含量比野生型增加51.51%，而沉默该基因则导致橡胶合成量减少至野生型的0.82倍。这证明了EuPPPDE8基因具有促进Eucommia橡胶生物合成的功能。这些研究结果为进一步阐明去泛素化调控在Eucommia ulmoides橡胶生物合成中的作用提供了重要的基础数据。

引言

Eucommia ulmoides（Oliv.）是一种具有显著经济价值的木质药用植物，由于其多种生物活性成分和独特的胶质特性，在医疗保健[1]、功能性饲料[2][3]和新型材料[4][5]领域具有广泛的应用前景。现代药理学研究表明，这种植物富含鸢尾素类化合物（如Geniposide和Aucubin）以及黄酮类化合物[6][7]，具有抗高血压、滋养肝肾和调节血液等作用[8]。Eucommia橡胶是一种存在于树皮中的天然橡胶，属于天然反式-1,4-聚异戊二烯。其独特的分子构象和生物相容性特性使其成为跨学科研究的热点。Eucommia橡胶的生物合成受到复杂分子网络的调控。法尼基焦磷酸合成酶（FPS）是合成法尼基焦磷酸（FPP）的关键酶，而FPP是橡胶合成的起始前体。研究表明，转录因子可以直接调控FPS基因的表达，从而影响橡胶产量。例如，北京林业大学的一个研究团队证实转录因子EuWRKY30可以直接结合到EuFPS1基因启动子上并激活其表达；EuWRKY30的过表达显著增加了Eucommia橡胶的含量[9]。同一团队还发现转录因子EuHDZ25是EuFPS1的另一个关键正向调控因子，其表达水平与胶质含量高度正相关[10]。这些发现揭示了Eucommia橡胶合成的核心转录调控机制。除了在E. ulmoides中的研究外，FPS的功能也在经典的产胶植物Hevea brasiliensis中得到了验证。Deng Xiaomin等人在2022年的研究表明，橡胶树乳汁中高表达的HbFPS1和HbFPS2可以直接催化FPP的合成，并显著提高体外橡胶合成效率，因此被认为是品种改良的关键功能酶[11]。

PPPDE超家族是一类新的去泛素化酶，广泛存在于真核生物和病毒中[12]。除了半胱氨酸肽酶结构域外，它们还具有泛素（Ub）结合结构域。该结构域包含一个Cys-His催化二聚体，并具有独特的环状排列的木瓜蛋白酶样折叠结构，由5个保守的α螺旋和6个β链组成。相应的催化二聚体由β链上的保守组氨酸残基和随后的α螺旋上的保守半胱氨酸残基形成（HC构型），其中组氨酸残基由一个保守的极性残基（通常是天冬氨酸）定向[13][14]。研究表明，PPPDE蛋白在细胞周期调控、胚胎发育和细胞凋亡中起着关键作用。例如，PPPDE家族成员DeSI1参与植物的先天免疫[15]；PPPDE1通过去泛素化作用稳定核糖体蛋白RPS7[16]；在辣椒中，CaDeSI2通过调节SUMO化影响植物对干旱和脱落酸（ABA）的反应[17]。植物PPPDE的独特结构域表明它们在进化过程中形成了特定的功能。例如，在Arabidopsis中，Desi1与AtC3H59共同调控种子萌发和幼苗发育[19]；PICI1通过其PPPDE结构域稳定OsMETS，促进蛋氨酸-乙烯的生物合成[20]。这些研究揭示了PPPDE在植物生长发育和应激反应中的多种功能，为理解泛素化调控机制提供了重要线索。在植物中，PPPDE基因家族的成员通过调控磷酸化状态影响多种生物过程，包括细胞分裂、分化和代谢以及应激反应。然而，PPPDE基因家族在Eucommia橡胶生物合成中的具体作用机制仍大多尚未探索。本研究旨在利用生物信息学方法全面鉴定E. ulmoides中的PPPDE基因家族成员，并探讨它们在Eucommia橡胶合成中的潜在调控作用。

在我们的初步研究中，在筛选Eucommia橡胶合成中的关键限速酶EuFPS1的相互作用蛋白时，我们鉴定出一种去泛素化酶家族成员。利用基于我们构建的E. ulmoides全基因组注释数据库中的参考序列设计的引物，通过快速扩增cDNA末端（RACE）克隆了相应基因。序列分析表明，该基因编码的蛋白质具有PPPDE结构域，属于新的含有肽酶结构域的酶（PPPDE）家族。根据其在E. ulmoides中与其他家族成员的染色体位置关系，我们将该克隆基因命名为EuPPPDE8。为了验证这种蛋白质-蛋白质相互作用，我们使用双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交（Y2H）实验在体内和体外确认了EuPPPDE8与EuFPS1之间的特异性相互作用。此外，我们还利用转基因技术分析了EuPPPDE8基因在Eucommia橡胶合成中的功能作用及其蛋白质相互作用网络，以阐明EuPPPDE8参与Eucommia橡胶合成的分子机制。

实验材料

植物材料

Eucommia ulmoides、Arabidopsis thaliana和烟草的种子来自贵州省农业科学院/贵州省植物保护技术应用工程研究中心的收藏。Eucommia ulmoides幼苗在25°C和70%相对湿度的控制条件下生长，光照时间为16小时，黑暗时间为8小时。经过10天的低温处理后，收获了一年生的幼苗

EuPPPDE8基因的克隆、鉴定和亚细胞定位

Eucommia ulmoides橡胶的生物合成受到多层次网络的调控。尽管对其转录调控已有较多了解，但关键的翻译后修饰机制仍不清楚。去泛素化酶可以逆转目标蛋白上的泛素标记，是控制蛋白质稳定性和活性的关键调控节点。PPPDE超家族是一类新的去泛素化酶，具有多样的功能

讨论

Eucommia ulmoides橡胶（反式-1,4-聚异戊二烯）是一种具有显著经济价值的天然聚合物材料，其生物合成调控网络仍大部分未被探索。本研究首次系统地鉴定了E. ulmoides中的PPPDE去泛素化酶基因家族，并深入分析了核心成员EuPPPDE8通过独特的蛋白质-蛋白质相互作用正向调控橡胶生物合成的分子机制

结论

本研究阐明了EuPPPDE8在调控Eucommia ulmoides橡胶生物合成中的作用。EuPPPDE8与EuFPS1相互作用，其过表达可增强FPS的活性，从而增加橡胶合成。相反，沉默EuPPPDE8会减少橡胶产量，表明EuPPPDE8在此生物合成途径中起正向调控作用。此外，我们的研究还发现了E3泛素连接酶EuMGRN1（参与泛素化过程）与

CRediT作者贡献声明

Huaijuan Jiao：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，正式分析。Dan Zhao：方法学，研究。Xi Chen：方法学，研究。Ying Zhu：方法学，研究。Yichen Zhao：资源获取，资金筹集，概念构思。De-gang Zhao：资源获取，资金筹集，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。