基于Limonia acidissima胶的生物聚合物/钐替代羟基磷灰石生物复合材料的合成，用于骨组织工程应用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Synthesis of Limonia acidissima gum-based biopolymer/samarium substituted hydroxyapatite biocomposite for bone tissue engineering applications

海洋生物废弃物转化为纳米生物材料的绿色策略。采用海藻酸（LAG）作为生物模板和稳定剂，通过离子掺杂制备铽掺杂羟基磷灰石（SmHAp）复合材料，实现骨组织工程的机械强化与抗菌功能协同。实验表明，5wt% LAG-SmHAp复合材料在14天内具有52%膨胀率和63.6%降解特性，体外成骨活性显著且对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈达18-19mm。细胞毒性测试显示IC50达99.3μg/mL，证实其生物相容性。该研究为可持续骨修复材料开发提供了新方法。

　　

梅里纳·卡维里（Merina Kaveri）|沙克·阿巴斯·沙贾汉（Shake Abbas Shajahaan）|戈皮·达纳拉杰（Gopi Dhanaraj）

印度泰米尔纳德邦塞勒姆（Salem）佩里亚尔大学（Periyar University）化学系，邮编636 011

摘要

将海洋废弃物转化为纳米结构生物材料为骨组织工程应用提供了一种经济高效且环保的策略。本文报道了利用Limonia acidissima胶（LAG）辅助的生物模板法合成棒状钐取代羟基磷灰石（SmHAp）生物复合材料的方法。LAG是一种天然植物聚合物，作为绿色结构导向和稳定剂；而钐的替代不仅提高了晶格稳定性、成骨潜力，还增强了抗菌活性。实验中使用了三种不同浓度的LAG（0.5%、2%和5%重量比），并系统地对其物理化学、功能及生物特性进行了表征。在PBS溶液中，LAG-SmHAp生物复合材料在14天内膨胀了52%，降解了63.6%。体外实验表明，该复合材料在浸入SBF培养基7天后形成了磷灰石层。在50和100 μg/mL浓度下，该材料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌表现出显著的抗菌活性，最大抑菌圈分别为18毫米和19毫米。对L929细胞的生物相容性评估显示其无毒，IC50值为99.30 μg/mL。相比之下，MG-63骨肉瘤细胞在12.5至200 μg/mL浓度范围内处理时，其增殖受到剂量依赖性的抑制。通过Alizarin Red S染色法观察HAp、SmHAp以及含0.5%和2%重量比LAG的SmHAp复合材料在5天和10天时的变化，发现钙沉积和矿化程度显著增加。综上所述，LAG辅助的SmHAp生物复合材料是一种可持续的多功能生物材料，非常适合用于骨组织工程。

引言

纳米制造的最新进展为开发先进的生物材料提供了可能，使得能够设计出与天然骨骼的层次结构和成分高度相似的复合材料[1]、[2]、[3]。尽管如此，目前仍缺乏有效材料来修复或再生因骨折、骨质疏松症、骨关节炎、骨肿瘤或其他骨骼疾病受损的骨骼。这些生物材料的表面特性、化学成分和内在生物活性在调节与周围骨细胞的相互作用中起着关键作用，从而影响细胞粘附、增殖、分化以及新组织的成功整合[4]、[5]、[6]、[7]。羟基磷灰石（HAp；Ca₁₀(PO₄)₆ (OH)₂）在物理化学和结构上与人体骨骼中的矿物质相一致。源自生物废物的HAp具有相同的晶体结构和成分，因此具有高度的生物相容性和生物活性。这种相似性使得HAp能够直接与骨组织结合，使其成为骨骼修复和再生的理想材料。它具备重要的生物相容性和骨传导性，有助于新骨的形成，非常适合治疗骨骼缺陷和骨骼疾病[8]、[9]、[10]、[11]。近年来，由于生物废物来源的HAp具有可持续性、经济性和环境友好性，其应用越来越受到关注。然而，HAp的化学合成需要高纯度试剂，这不仅增加了总体成本，还对环境造成较大影响。天然来源如蛋壳、蛤壳、蜗牛壳[12]、贻贝壳[13]、蟹壳、鱼骨、牛骨和羊骨富含钙，可转化为HAp[14]、[15]、[16]。其中，三斑蟹壳（Portunus sanguinolentus）是海鲜市场的常见副产品，是一种丰富且可持续的钙来源。这些壳主要由碳酸钙组成，易于转化为HAp，是一种环保且经济高效的前体[17]、[18]。利用这种海洋废弃物不仅提高了废弃材料的价值，还减少了环境影响。来自天然来源的HAp由于含有Na⁺、Mg²⁺和K⁺等微量元素，更接近人体骨骼的成分，这些元素会影响其溶解度、结晶度和生物活性。尽管如此，纯HAp天然较为脆，机械强度低，且不易被身体吸收，限制了其长期临床应用。因此，开发结合HAp与功能性添加剂的复合材料至关重要，以提升其机械强度、生物性能和治疗效果[19]、[20]。

为克服这些缺点，通过在磷灰石晶格中进行离子替代是一种有效的改进方法。用Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Sr²⁺、Ag⁺、Ba²⁺、Y³⁺、La³⁺、Sm³⁺、Ce³⁺和Eu³⁺等生物活性离子替代Ca²⁺离子，可以改善HAp的生物性能[21]、[22]、[23]、[24]。其中，钐（Sm³⁺因其独特的性质组合而受到关注。Sm³⁺的离子半径（1.08 ?）与Ca²⁺（1.00 ?）非常接近，能够稳定地替代HAp晶格，且几乎不改变其结构，同时增强结晶度。重要的是，Sm³⁺替代不仅增强了晶格强度，还提高了成骨细胞增殖、抗菌、抗氧化和抗炎活性，从而加速组织修复。因此，Sm³⁺在单一替代框架内提供了机械强化、成骨刺激和抗菌作用的独特组合，使其成为基于HAp的生物材料的理想替代品[25]、[26]。

除了离子替代外，生物聚合物辅助的模板法已成为调节生物材料中粒子大小、形态和分散性的绿色高效方法[27]、[28]、[29]、[30]。Limonia acidissima（属于芸香科）是一种天然胶状物，源自印度干燥落叶林和岩石地区的树木树干。其含有的羟基和羧基团能与钙和磷酸根离子相互作用，引导晶核形成、稳定晶体生长并调控粒子形态，使其成为理想的软模板。LAG的化学成分包括多糖、蛋白质、黄酮类和酚类化合物，这些成分不仅有助于模板形成，还赋予其抗氧化、抗菌和潜在的抗癌活性[31]。与其他天然胶如阿拉伯胶[32]、瓜尔胶[33]或黄原胶相比，LAG具有更高的粘度、凝胶形成能力和更丰富的功能基团，有助于合成尺寸和形状均一的棒状HAp纳米颗粒。此外，与聚己内酯（PCL）、聚乙烯醇（PVA）、聚乳酸（PLA）、聚乙二醇（PEG）和聚甘醇酸（PGA）等合成聚合物不同，LAG完全生物相容、可生物降解且经济高效[34]、[35]、[36]。

过去二十年里，关于羟基磷灰石的研究显著增加，重点集中在骨再生、生物相容性和抗菌性能方面。文献计量分析（图1）进一步显示了研究趋势的上升，以及人们对离子替代和基于天然聚合物的复合材料在增强多功能性方面的兴趣增加[37]、[38]、[39]。然而，将稀土替代离子与天然胶结合用于制备生物材料的研究仍较为有限。本文首次报道了使用LAG作为天然生物模板，并以三斑蟹壳作为海洋生物废物来源的钙源，制备SmHAp生物复合材料，用于骨组织工程应用。这种方法结合了LAG辅助的生物模板法和Sm³⁺离子替代，实现了均匀的棒状SmHAp的形成，其物理化学、抗菌和生物性能得到改善，这些性能通过多次重复的体外实验得到验证，确保了结果的一致性。总体而言，所提出的方法为开发用于骨骼修复的多功能HAp基生物复合材料提供了可持续的途径[40]、[41]、[42]、[43]。

材料

实验中使用了三斑蟹壳（Portunus sanguinolentus）、Limonia acidissima胶、磷酸二氢铵[(NH₄)₂HPO₄（纯度99%，Sigma–Aldrich）、六水合硝酸钐[Sm(NO₃)₃·6H₂O（纯度99.95%，SRL）、丙酮和氨水溶液（25% NH₄OH）。所有化学品均经过纯度检测，无需进一步纯化。整个实验使用去离子水（DI）进行。

从三斑蟹壳制备氧化钙

在印度泰米尔纳德邦塞勒姆的当地市场收集了三斑蟹壳。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）

图3a-f展示了三斑蟹壳衍生的CaO、HAp、含0.5%和2%及5%重量比LAG的SmHAp生物复合材料的FTIR光谱。CaO的光谱（图3a）显示了3646和3430 cm^?1处的O-H伸缩带，1454和1052 cm^?1处的碳酸根峰，以及875 cm^?1处的Ca-O伸缩带，证实了CaO的形成。转化为HAp后，光谱显示了1091–1045 cm^?1（v₃）和964 cm^?1（v₁）处的特征磷酸盐振动，以及603和560 cm^?1（v₄）处的弯曲模式。

结论

本研究通过利用三斑蟹壳（Portunus sanguinolentus）衍生的钙前体，采用生态可持续的生物启发方法制备了LAG模板化的钐取代羟基磷灰石（SmHAp）生物复合材料。LAG同时作为天然生物模板和结构基质，引导棒状纳米晶体的各向异性生长，并形成致密的有机-无机杂化框架。结构和形态分析证实了这一方法的成功。

CRediT作者贡献声明

梅里纳·卡维里（Merina Kaveri）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验实施、数据管理、概念构思。 沙克·阿巴斯·沙贾汉（Shake Abbas Shajahaan）：方法学设计、数据分析。 戈皮·达纳拉杰（Gopi Dhanaraj）：撰写——审稿与编辑、指导、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文工作的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢印度新德里的大学拨款委员会（University Grants Commission）提供的Savitribai Jyotirao Phule Single Girl Child Fellowship（编号：82-7/2022(SA-III)，以及Anusandhan国家研究基金会 - Inclusivity Research Grant（编号：ANRF/IRG/2025/002021/ENS）的财政支持，以完成这项工作。