一种新型的PVA/明胶水凝胶混合物，结合了多巴胺改性的微晶纤维素颗粒，用于纳林酶的固定化应用

《International Journal of Biological Macromolecules》：A novel PVA/gelatin hydrogel hybrid integrated with polydopamine-modified microcrystalline cellulose particles for the application in naringinase immobilization

本研究采用体相掺杂策略制备了聚乙烯醇/明胶/聚多巴胺微晶纤维素复合水凝胶，用于naringinase固定化。该方法通过在合成过程中均匀掺杂PDA-MCC，形成高密度均匀分布的结合位点，解决了传统表面修饰方法活性位点不足和酶负载量低的问题。优化后的水凝胶在最佳条件下酶活性达666.91 U/g，且具有优异的稳定性和重复使用性，一个月后活性保留85.26%，十次循环后保留59.31%。结果表明，该新型水凝胶为生物催化提供了高效稳定的固定化载体。

　　

Fanghong Sun|Qian Li|Shanquan Wang|Chunfeng Hu|Miao Li|Xiaoyi Chen|Xitong Sun|Xianzhen Li

大连理工大学生物工程学院，中国大连，116034

摘要

聚合物水凝胶由于其三维网络结构和强大的吸附性能，为酶的固定提供了一个有前景的平台。然而，传统的表面改性策略往往限制了活性位点的可用性和酶的负载量。为了解决这些问题，开发了一种称为“整体掺杂”的新策略。与其他方法（如在载体表面涂覆PDA）不同，整体掺杂方法在合成过程中将聚多巴胺功能化的微晶纤维素（PDA-MCC）均匀地结合到聚乙烯醇/明胶（PVA/Gel）水凝胶中。这种三维网络提供了高密度的均匀分布的结合位点，解决了以往方法中的扩散和负载限制问题。在最佳条件下，固定的柚皮苷酶的酶活性达到了666.91 U/g载体。在4°C下储存一个月后，其酶活性仍保留了85.26%，经过十次重复使用后，酶活性仍保持在59.31%。这些结果表明，通过整体掺杂方法制备的PMPG水凝胶作为柚皮苷酶的载体具有高效性和稳定性，为传统的基于水凝胶的固定系统提供了一个可靠的替代方案。

引言

柚皮苷酶是一种由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成的多酶复合物，可催化柚皮苷和其他黄酮类化合物的水解[1]、[2]。这一生物催化功能在食品和制药工业中具有重要的价值，特别是在去除柑橘汁中的苦味和提高黄酮类化合物的生物利用度方面[3]。酶的固定有效地提高了操作稳定性和重复使用性，从而解决了游离酶的关键限制[4]。选择合适的载体材料至关重要，理想的载体应具有稳定性、成本效益和环境友好性[5]。已经使用了多种材料（包括介孔二氧化硅[6]、纳米材料[7]和碳基载体[2]）来固定柚皮苷酶。然而，这些系统的性能往往受到所选固定策略的限制。

共价固定方法（如使用戊二醛交联的MCM-41）虽然减少了酶的泄漏，但会导致构象僵硬和质量传递障碍[8]、[9]。这些缺点通常会导致重复使用过程中的活性显著下降，例如六次使用后仅保留了44.57%的活性[6]。相反，物理包埋在聚合物中可以提供较为温和的微环境，但通常会导致酶的逐渐泄漏和扩散限制[10]、[11]，导致八次使用后活性下降了62.01%[2]。

水凝胶具有亲水的三维网络结构[12]，可以提供一个水合且保护性的基质，特别适合在许多生物催化系统中用于酶的固定[13]、[14]。受这些优点的启发，本研究旨在开发一种基于生物聚合物的新型复合水凝胶用于柚皮苷酶的固定。明胶是一种天然蛋白质，具有生物相容性、低成本和丰富的官能团，但其较弱的机械强度和热稳定性限制了其独立应用[15]、[16]。为了增强基质，引入了聚乙烯醇（PVA）通过氢键形成互穿网络，从而提高了结构完整性[17]。进一步加入微晶纤维素（MCC）作为生物基填料，以改善机械和热性能，并调节基质孔隙度以促进底物扩散[18]、[19]。

为了引入强效且多功能的酶结合位点，通过多巴胺的自聚合在MCC表面进行了PDA涂层处理。PDA具有优异的生物相容性[12]、固有的无毒性[20]、强粘附性以及高密度的儿茶酚/醌基团，有利于酶的牢固附着[21]、[22]。与传统的合成后表面涂层不同，后者通常会产生不均匀且表层的PDA层，本研究开发了一种创新的“整体掺杂”策略。在这种策略中，PDA改性的MCC颗粒在水凝胶形成过程中均匀分散在PVA/明胶基质中，形成了一个具有丰富且均匀分布的结合位点的三维网络，旨在最大化酶的负载量，同时保持良好的微环境并减轻质量传递限制。

本文报道了一种新型PVA/明胶/PDA-MCC复合水凝胶的制备、优化和表征，用于柚皮苷酶的固定。系统地优化了固定条件，并全面评估了固定后柚皮苷酶的酶活性、稳定性和重复使用性。

材料

Aspergillus niger FFCC uv-11菌株来自我们实验室的自保存菌株，通过该菌株生产了柚皮苷酶发酵液，其柚皮苷酶活性为856.96 U/mL。柚皮苷（质量分数≥98%）购自宝鸡方盛生物发展有限公司。氢氧化钠、盐酸、柠檬酸和磷酸二氢钠购自天津科密欧化学试剂有限公司。Tris(羟甲基)甲基氨基甲烷购自中国药科大学。

柚皮苷酶固定的最佳PDA-MCC添加量

图1显示了PDA-MCC添加量对固定后柚皮苷酶活性的影响。随着PDA-MCC添加量的增加，酶活性也随之增加，在添加0.8克时达到最大值。超过最佳添加量后，酶活性开始下降。这种下降可能是由于水凝胶网络内颗粒过度拥挤，限制了底物的扩散和酶活性位点的接触[28]。

SEM和EDS分析

SEM的结果显示...

结论

本研究通过整体掺杂策略合成了用于柚皮苷酶固定的新型水凝胶。该策略在载体内部形成了一个保护性的、高表面积的网络，从而提高了酶的活性和稳定性。与游离酶相比，固定的柚皮苷酶显示出显著提高的活性和稳定性，以及对pH值和温度变化的更好耐受性。这项工作为传统的表面限制方法提供了一个实用的替代方案。

作者贡献声明

Fanghong Sun：撰写——初稿、研究、数据分析。Qian Li：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资金筹集。Shanquan Wang：数据分析。Chunfeng Hu：数据分析。Miao Li：撰写——审稿与编辑、监督。Xiaoyi Chen：撰写——审稿与编辑、监督。Xitong Sun：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资金筹集。Xianzhen Li：

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：21804129和31601411）和辽宁省教育厅科研项目（项目编号：JYTMS 20230423和J2020096）的支持。我们感谢大连理工大学分析中心在测试分析方面提供的支持。