《International Journal of Biological Macromolecules》：Chitosan-coated copper sulfide liposomes enhance chemo/immuno/chemodynamic therapy via enhanced ferroptosis-mediated glioma cell death
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铁依赖性细胞死亡免疫治疗协同增强胶质瘤抑制效果研究，通过脂质体包裹铜硫化物纳米颗粒（LCSG）实现化学动力学与葡萄糖饥饿联合治疗，促进活性氧积累和免疫原性细胞死亡，有效抑制胶质瘤且无毒性。
周青久|傅强|李少山|库格尔库·亚利坤|孙亚星|孙振兴
新疆医科大学第一附属医院神经外科，乌鲁木齐，83000，中国
摘要
由于胶质瘤具有高度侵袭性的生长特性，通过标准外科手术完全切除它们面临着相当大的挑战。目前，免疫疗法在许多癌症的治疗中取得了显著进展；然而，由于胶质瘤独特的免疫抑制性肿瘤微环境，它们对免疫疗法的反应并不明显。本研究展示了使用脂质体（LCSG）显著增强了免疫疗法治疗胶质瘤的效果。通过各种分析和光谱方法对LCSG进行了表征。通过吸光度和荧光显微镜检测了铁死亡（Ferroptosis）现象。LCSG的直径约为200纳米，壳聚糖的包封效率和载药量分别为58%和8.3%。在细胞内吞作用后，葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，产生H?O?作为副产物，从而促进饥饿疗法。这些特性可能会加剧抗氧化系统的功能障碍，并增强Cu2+介导的芬顿反应（Fenton-like reactions），导致脂质过氧化和铁死亡的发生。此外，铁死亡的启动会引发免疫原性细胞死亡，并促使损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns）的释放，从而促进细胞毒性T细胞的浸润（15.7%）和树突状细胞的成熟（27.5%）。所有实验均证实，LCSG能够在不产生任何有害效应的情况下显著抑制胶质瘤的生长。总体而言，我们的发现表明，通过化学动力学疗法（chemodynamic therapy）调节免疫抑制性肿瘤微环境可能是增强胶质瘤免疫疗法的关键方法。
引言
胶质瘤是一类起源于神经胶质细胞的中枢神经系统癌症[1]。胶质瘤是脑肿瘤的主要类型，约占所有脑肿瘤的30%和所有原发性脑恶性肿瘤的80%[2]。胶质瘤的管理通常需要结合手术干预、放疗、化疗和免疫疗法[3]。血脑屏障（BBB）以及胶质瘤对治疗药物的固有抵抗性给有效药物输送到肿瘤部位带来了重大障碍。因此，胶质瘤的术后复发率较高，导致整体治疗效果不佳[4]。因此，开发针对胶质瘤的疗法有望克服BBB渗透的限制，并提高药物的肿瘤特异性给药效果[5]。
铁死亡（Ferroptosis, FT）是一种新发现的铁依赖性程序性细胞死亡方式，其特征是活性氧（ROS）的积累和过度的脂质过氧化（LPO），其效果与细胞的抗氧化能力密切相关[6]。还原型谷胱甘肽（GSH）是细胞内的主要抗氧化剂，在GPX4依赖的铁死亡过程中起着关键的保护作用。抑制谷氨酸-半胱氨酸转运蛋白Xc?（xCT）系统的FT诱导剂会降低GSH水平并促进LPO的积累[7]。IKE在多种癌细胞系中表现出抗癌活性。Erasstin可以降低人类癌细胞的顺铂耐药性。当与多柔比星联合使用时，IKE增强了多柔比星的效果并诱导了癌细胞的铁死亡[8]。铁死亡还可以在癌细胞中引发免疫原性细胞死亡（ICD）级联反应，从而通过释放多种损伤相关分子模式（包括ATP、高迁移率族box 1蛋白和钙网蛋白）来增强免疫疗法[9]。铁死亡是由CD8+ T淋巴细胞调节的生理性细胞死亡形式[9]。经历铁死亡的细胞产生的损伤相关分子模式可以刺激免疫系统，而主要由细胞毒性T淋巴细胞产生的IFN-γ也可以诱导铁死亡[10]。我们发现铁死亡相关基因与患者的免疫状态和预后结果之间存在显著相关性[11]。我们认为，将铁死亡与免疫疗法结合是一种治疗胶质瘤的可行策略。然而，缺乏肿瘤选择性和潜在的系统毒性限制了其在体内的应用。我们提出开发一种纳米平台，用于将LCSG输送到胶质瘤部位，同时修改肿瘤的免疫微环境[12]。
GPX4是铁死亡抑制中的关键信号成分，它与GSH相互作用以分解致命的LPO，而FSP1则通过再生作用隔离LPO自由基[13]。葡萄糖氧化酶（GOD）可以将葡萄糖氧化为不可代谢的葡萄糖酸（GA），从而产生H?O?作为副产物[14]。GOD的结合可能有助于抑制上述抗铁死亡途径，并促进持续的芬顿反应，从而增强铁死亡和随后的抗肿瘤免疫反应[15]。化学动力学疗法（CDT）中的芬顿反应旨在在温和酸性和中性生理条件下建立具有增强纳米催化活性的新型芬顿试剂[16]。某些聚合物（特别是壳聚糖）的应用可以抑制纳米粒子的聚集并提高其保护效果。用壳聚糖包封或涂层可以增加其生物利用度和载体稳定性，以实现有效的药物输送。壳聚糖是一种从几丁质中提取的天然聚合物，具有无毒、生物相容性和可生物降解性。由于其多阳离子特性，它可以稳定纳米粒子并提高其稳定性。壳聚糖的负电荷在材料表面产生静电排斥力，从而形成稳定的悬浮液。基于硫化铜（CS）的纳米粒子常被用作降解污染物和有机染料的催化剂，在催化降解治疗中显示出巨大潜力[17]。Cu+催化的芬顿反应在能量和动力学效率方面优于Fe2+/Fe3+反应。有报道称，Cu+催化的芬顿反应在酸性和中性条件下表现出显著的疗效[18]。尽管如此，关于基于CS的纳米材料在癌症化疗中的应用报道较少，除了新开发的自组装铜-氨基酸纳米粒子[19]。基于CS的纳米材料因其近红外范围内的良好吸收、优异的生物相容性和优越的光热转换效率而成为研究的重点[20]。与其他基于CS的材料相比，CS纳米粒子因其近红外光学吸收、出色的光热性能以及铜作为人体必需微量元素的重要性而特别引人注目[21]。
脂质体是自组装的球形实体，它们在其脂质双层结构中封装了水性介质[22]。由于其类似于细胞结构、生物相容性、低毒性、易于生产、能够封装亲水性和/或疏水性药物以及能够将治疗药物输送到特定部位的能力，脂质体已成为药物输送系统中的重要工具[23]。已经研究了装载化疗药物的脂质体，以克服血脑屏障并减少胶质母细胞瘤治疗中的系统毒性[24]。还开发了低毒性和低药物消耗的有效局部药物输送模型。然而，脂质体在药物释放实验中存在局限性，包括不稳定性、半衰期短以及被单核细胞-巨噬细胞系统失活[6]。通过将载药脂质体结合到水凝胶基质中，可以调节受控的药物释放动力学，以解决这些限制[25]。脂质体具有低毒性和生物相容性，是跨血脑屏障输送多种药物的有效载体[26]。在依赖增强的渗透性和保留效应的被动靶向策略中，脂质体表现出增强的吸收效果，这一现象与胶质瘤的完整性受损有关[27]。我们最初将CS与GOD结合，然后将其混合物封装在脂质体中，开发出用于诱导铁死亡的LCSG。一旦被U251细胞内吞，释放的GOD会降低细胞内的葡萄糖水平并增加酶促反应速率；同时产生的H?O?可能增强Cu2+/Cu+介导的芬顿反应。因此，细胞内的ROS水平可能会增加，从而导致铁死亡（图1）。LCSG可以同时抑制抗铁死亡途径并改善LPO，从而诱导铁死亡和ICD，为增强胶质瘤免疫疗法提供新的方法。
材料与试剂
所有其他化学品均为分析试剂级，购自中国上海的Sinopharm Chemical Reagent。所有实验均使用了电阻率为18.2 MΩ·cm的超纯水（UPW）。
壳聚糖包覆的硫化铜纳米粒子（CS NPs）的制备
根据既定方案制备了CS NPs[28]。具体来说，将CuCl?·2H?O（10.77 mg）和Na?S·9H?O（10 mg）溶解在40 mL的UPW中。15分钟后，迅速加入100 μL（10 mg/mL）的水溶液并剧烈搅拌。随后对溶液进行加热
LCSG NPs的制备与表征
TEM分析显示CS NPs具有均匀的球形形态（图1A）。CS NPs是通过功能基团修饰合成的。随后，使用薄膜分散法合成了脂质体和LCSG。图1A显示了包裹在脂质体表面的膜层。LCSG NPs的直径略大于脂质体。此外，元素映射图像显示碳、铜和硫均匀分布（图1
结论
本研究通过使用多功能脂质体（LCSG）整合化学动力学和饥饿疗法，显著增强了胶质瘤的免疫治疗效果。一旦被胶质瘤细胞内吞，LCSG通过葡萄糖氧化产生自生成的H?O?，进而通过Cu2+介导的芬顿反应生成大量ROS。这种快速的ROS生成可能触发胶质瘤细胞的铁死亡，并引发ICD反应，从而提高胶质瘤治疗的疗效
作者贡献声明
周青久：撰写原始稿件、可视化处理、数据验证、资源获取、概念构思。傅强：撰写原始稿件、可视化处理、数据验证、方法学设计、实验实施、概念构思。李少山：撰写原始稿件、可视化处理、软件应用、数据管理、概念构思。库格尔库·亚利坤：撰写原始稿件、可视化处理、数据验证、软件应用、资源获取、概念构思。孙亚星：撰写原始稿件、可视化处理、数据验证、实验监督
同意参与
不适用。
出版同意
不适用。
伦理批准
从湖南SJA实验动物有限公司获得了6周大的BALB/c雄性小鼠。所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》中的协议进行。这些程序（TUDN2025051）得到了北京清华长庚医院神经外科、清华大学临床医学院以及动物护理和使用委员会的批准。小鼠被饲养在标准的无菌（SPF）设施中
资助
本研究得到了北京清华长庚医院基金（编号：12015C1045）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
