《International Journal of Biological Macromolecules》：Pivotal role of FARP2 in TGF-β1-mediated myofibroblast differentiation and corneal fibrosis
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角膜基质纤维化主要由TGF-β1介导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转化引起，FARP2作为Rho-GTP酶信号通路的关键调控者，其功能在纤维化中的具体作用尚未明确。本研究通过siRNA沉默FARP2，发现其显著抑制TGF-β1上调的COL1A1、RHOA、TLN1和SLC2A4表达，并减弱α-SMA表达及 scratch实验中细胞迁移能力，证实FARP2是TGF-β1介导角膜纤维化的重要下游调控因子。
Lina Moallemi Rad | Abasalt Hosseinzadeh Colagar | Asieh Hosseini | Ali-Akbar Delbandi
分子与细胞生物学系，马赞德兰大学基础科学学院，邮编：4741695447，巴博尔斯阿，伊朗
摘要
角膜基质纤维化是导致视力障碍的主要原因之一，这一过程主要由TGF-β1介导的基质成纤维细胞向收缩性肌成纤维细胞的转变所驱动。FARP2是一种参与Rho-GTP酶信号传导和细胞骨架组织的介质，已被提出可能作为这种表型转变的中介因子；然而，其在基质重塑中的具体功能贡献仍不明确。本研究从新西兰兔子中分离出角膜基质细胞（CSFs），并在标准条件下进行培养。使用重组TGF-β1（5和20 ng/mL）诱导肌成纤维细胞分化。通过序列特异性siRNA实现FARP2基因沉默。利用实时PCR定量检测、RHOA、TLN1、SLC2A4以及纤维化细胞外基质标志物COL1A的基因表达水平，并以log2倍数变化表示；同时通过Western blotting检测FARP2蛋白表达。通过免疫细胞化学评估α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达情况，利用划痕实验分析细胞的迁移能力。TGF-β1处理显著诱导了类似肌成纤维细胞的形态变化并增加了α-SMA的表达。此外，TGF-β1还以剂量依赖性方式上调了COL1A1的表达，表明细胞外基质重塑增强。FARP2基因敲低有效抑制了这些转录反应并显著降低了FARP2蛋白水平（p < 0.05）。在划痕实验中，TGF-β1显著促进了伤口闭合，而FARP2沉默则显著减少了细胞迁移并延缓了伤口修复（p < 0.0001）。此外，在缺乏功能性FARP2的情况下，葡萄糖和TGF-β1诱导的SLC2A4上调作用显著减弱。这些发现表明FARP2是一个潜在的治疗靶点。针对FARP2可能是一种预防或减少角膜纤维化和瘢痕形成的有效方法。
引言
基质层约占角膜厚度的90%，负责维持角膜的透明度，这对视觉功能至关重要[1]、[2]。在机械损伤、感染或手术创伤后，角膜基质会经历一个修复过程，由于基质成纤维细胞异常激活并分化为收缩性肌成纤维细胞（MyoFs），常常导致纤维化和透明度丧失[3]、[4]。这些表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）并沉积过多细胞外基质（ECM）的MyoFs是导致角膜混浊和视力下降的原因[5]、[6]。更好地理解成纤维细胞向肌成纤维细胞转变（FMT）的分子机制对于开发治疗角膜瘢痕形成的策略至关重要[7]、[8]。
在角膜伤口愈合和纤维化调节中起核心作用的细胞因子是转化生长因子-β1（TGF-β1）[9]。研究表明，TGF-β1信号传导可激活Smad依赖性和非Smad依赖性信号通路（包括Rho-GTP酶级联），从而在角膜损伤后介导细胞骨架重塑、细胞收缩和细胞外基质生成[10]。Rho家族的Rho-GTP酶，特别是RhoA成员，控制应力纤维的形成、 focal adhesion的更新和肌动蛋白-肌球蛋白的收缩，这些都是肌成纤维细胞分化和迁移的重要因素[11]、[12]、[13]。尽管已知Rho-GTP酶调节因子在纤维化相关疾病中起作用，但控制角膜基质成纤维细胞（CSFs）中这些过程的上游调节因子尚未明确[14]、[15]。
FARP2基因编码FARP2蛋白，这是一种多结构域蛋白，可调节Rho和Rac GTP酶，并参与细胞骨架组织和细胞极性（FARP2、FERM、RhoGEF和含有pleckstrin结构域的蛋白2）[16]、[17]。FARP2最初在神经系统中被发现，但现在已知它还调节多种细胞类型的肌动蛋白动态、focal adhesion组装和细胞运动[17]。最新研究表明，FARP2还参与其他病理重塑事件，如癌细胞侵袭和组织纤维化，可能是连接细胞外信号与细胞骨架重组的分子节点[18]、[19]、[20]。
然而，FARP2在TGF-β1诱导的CSFs纤维化转变中的作用尚未明确。由于细胞骨架和细胞-基质相互作用对纤维化过程至关重要，我们假设FARP2可能在TGF-β1介导的肌成纤维细胞分化和迁移中起核心作用。为了验证这一假设，我们使用以下方法测试了siRNA介导的FARP2沉默对兔子CSFs中TGF-β1诱导的细胞反应的影响：（i）评估α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达；（ii）评估RhoA和Talin（TLN1）信号通路；（iii）评估最近被发现在成纤维细胞代谢和激活中起作用的葡萄糖转运蛋白SLC2A4；（iv）使用划痕实验评估FARP2敲低对成纤维细胞迁移行为的功能影响。
因此，本研究的中心目标是探讨FARP2是否作为TGF-β1诱导的角膜基质成纤维细胞肌成纤维细胞分化、细胞骨架重塑和迁移反应的关键中介因子。我们假设FARP2在TGF-β1刺激后激活下游纤维化信号通路中起必需作用。本研究提供了关于FARP2在角膜基质重塑中作用的新机制见解，并将其确定为预防纤维化和保持角膜透明度的潜在治疗靶点。
部分内容摘录
角膜基质细胞的分离与培养
从伊朗巴斯德研究所购买了三只雄性新西兰兔子（约2公斤），并在标准条件下（22 ± 2°C，12小时光照周期）适应一周。所有操作均符合批准的动物伦理指南。在层流罩（Kojair Tech Oy Co., Finland）下进行眼球摘除，并沿角膜缘解剖角膜，然后用PBS（Sigma-Aldrich Co., USA）冲洗两次。这些组织用20号手术刀片切碎
α-SMA的上调证实了TGF-β1诱导的肌成纤维细胞分化
免疫细胞化学分析显示，TGF-β1处理诱导了角膜基质成纤维细胞（CSFs）中肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达（图1-A）。每个实验组获取三张代表性图像，包括PI核染色（红色通道）、α-SMA免疫荧光（绿色通道）以及相应的合并图像。在对照组中未检测到α-SMA信号，仅可见PI染色的细胞核。
讨论
本研究表明，TGF-β1刺激和siRNA介导的FARP2抑制影响了角膜基质成纤维细胞的分化、迁移、表型及相关信号通路。
形态学和显微镜观察结果支持了分子研究结果。在正常培养条件下，角膜基质细胞呈现典型的细长纺锤形形态，具有分支的细胞质，在较高细胞密度下排列有序。暴露于TGF-β1后
结论
在本研究中，我们通过多种分子和细胞实验（如免疫细胞化学、实时PCR、Western blotting和划痕实验）研究了转化生长因子β-1和FARP2基因对角膜成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的影响，以及参与纤维化的分子通路。结果表明，TGF-β1处理导致明显的表型变化和肌成纤维细胞增加
CRediT作者贡献声明
Lina Moallemi Rad：撰写 – 原稿、方法学、研究设计、数据分析。Abasalt Hosseinzadeh Colagar：撰写 – 审稿与编辑、项目监督、概念构思。Asieh Hosseini：撰写 – 审稿与编辑、资源协调、数据分析。Ali-Akbar Delbandi：撰写 – 审稿与编辑、资源协调、数据分析。
伦理批准声明
本研究已获得马赞德兰大学研究伦理委员会的批准（IR.UMZ.REC.1401.077）。
资助
我们感谢马赞德兰大学（伊朗）提供的财政支持，特别感谢Lina Moallemi Rad博士（#IranDoc1735293）。
致谢
我们衷心感谢马赞德兰大学分子与细胞生物学系以及伊朗医科大学Razi草药医学研究中心和免疫学系的同事们提供的宝贵支持。特别感谢所有实验室成员的合作、富有洞察力的讨论和重要贡献，这些都对本研究的成功起到了关键作用。
