《International Journal of Biological Macromolecules》：An integration strategy of semi-continuous batch fermentation and foam separation: In situ concentration and recovery of recombinant β-glucosidase
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本研究开发了一种结合半连续批次发酵与泡沫分离技术的重组β-葡萄糖苷酶现场浓缩与回收策略。优化后的第三批次发酵产酶活达3.52±0.02 U/mL，生产率36.67±0.21 U/L·h。泡沫分离技术实现2.43±0.03的富集因子，94.56±0.73%的酶活性回收率，并显著提升纤维素共水解效率达2.5倍，验证了该技术体系在工业酶回收中的高效性与经济性。
赵成利|李青|杨帆|马新楠|吴家聪|韩娟|王磊|王云
中国江苏省镇江市江苏大学食品与生物工程学院，212013
摘要
传统的酶回收工艺步骤繁琐、能耗高且效率低，导致产品产量低、酶活性损失严重以及生产成本高昂。因此，开发一种高效、温和且流程简化的酶回收技术至关重要。在本研究中，我们采用半连续批次发酵与泡沫分离相结合的方法，实现了重组β-葡萄糖苷酶在发酵液中的原位浓缩与回收。通过优化重组β-葡萄糖苷酶的生产工艺并缩短发酵周期，采用每96小时收获一次的半连续补料批次发酵方式，最终获得了3.52±0.02 U/mL的酶活性和36.67±0.21 U/L·h的生产率。在最佳条件下，结合泡沫分离技术后，实现了2.43±0.03的富集因子、70.94±0.87%的蛋白质产量以及94.56±0.73%的酶活性回收率。这种回收的重组β-葡萄糖苷酶在协同水解羧甲基纤维素和纤维素时，使糖化效率提高了2.5倍；其对于棉子糖的糖化效率与商用酶相当。该发酵系统能够同时实现重组β-葡萄糖苷酶的原位浓缩与回收，有效减少了酶回收所需的步骤，并保持了较高的酶活性，显示出在工业规模应用中的巨大潜力。
引言
β-葡萄糖苷酶（E.C.3.2.1.21）是一种存在于细菌、真菌和植物中的水解酶[1]，在纤维素水解过程中起着关键作用。它能作用于非还原端的β-葡萄糖苷键，释放出葡萄糖及其相应的非糖部分。这一反应过程被认为是纤维素转化为葡萄糖的限速步骤[2]。目前，β-葡萄糖苷酶已应用于食品[3]、制药[4]、生物质转化[5]和农业[6]等多个领域。微生物酶生产是制备β-葡萄糖苷酶的主要方法，其中真核生物表达系统具有发酵周期短、诱导效率高以及分离纯化简便等优点[7]。然而，微生物发酵液成分复杂，包含微生物生物质、残留培养基、大量污染蛋白、无机盐和多种微生物代谢产物，导致酶纯化过程耗时较长。因此，β-葡萄糖苷酶的回收技术对于降低酶制剂的生产成本至关重要。
外源表达重组蛋白的回收通常采用三阶段策略[8][9]：首先通过离心或过滤去除发酵液中的固体生物质（如微生物细胞），获得粗酶提取物；其次通过盐析、有机溶剂沉淀或等电点沉淀进行初级纯化，以浓缩目标酶并去除大量杂质[10]；最后利用凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱和疏水相互作用色谱等多柱层析技术进行高纯度纯化[11]。但这些方法往往涉及多步骤操作，容易导致产品产量降低、生产成本上升和酶活性损失。因此，开发一种高效、温和的β-葡萄糖苷酶回收技术十分必要。
泡沫分离技术基于表面吸附原理，利用气泡作为分离介质。该技术通过利用目标成分在气液界面的吸附性质差异以及泡沫层内的排水效应实现富集和浓缩[12]。蛋白质是由极性氨基酸和非极性氨基酸通过肽键连接形成的两亲性分子，它们会自发聚集在气液界面形成稳定的粘弹性膜[13][14][15]。基于这一原理，泡沫分离技术能够有效从稀溶液中分离出表面活性酶分子。张等人[16]使用溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）对Trametes hirsuta发酵液中的漆酶进行泡沫分级分离，并通过β-环糊精和超声处理实现漆酶活性的73.4%回收率和11.9的富集比；邵等人[17]利用泡沫分离技术从Pichia pastoris发酵液中提取南极假丝酵母脂肪酶B（CALB），优化后CALB的富集比达到0.95，酶活性回收率为80.32%，证明了该方法的有效性。对于发酵液中的生物活性成分的泡沫分离，首先在发酵罐中进行发酵，发酵完成后将发酵液转移至泡沫分离装置进行分离。该技术已应用于细菌发酵液[18]、真菌发酵液[19]和细胞培养液[20]的分离。然而，这种转移过程较为繁琐，可能导致酶失活。因此，将发酵装置与泡沫分离装置结合，并优化设备设计和工艺流程是研究的重点。
本研究将半连续批次发酵与泡沫分离相结合：首先在发酵罐中合成重组β-葡萄糖苷酶，然后通过原位浓缩直接从发酵液中分离目标酶，实现了β-葡萄糖苷酶的快速回收。这种集成策略显著减少了蛋白质回收的操作步骤，同时保持了目标酶的高活性，具有重要的工业应用价值。具体研究内容包括：(i) 构建重组质粒pPIC9K-Glu-his-linker-GB并筛选高产菌株；(ii) 优化Pichia pastoris中的重组β-葡萄糖苷酶表达条件；(iii) 在批次发酵基础上进行半连续批次发酵；(iv) 结合半连续批次发酵与泡沫分离实现重组β-葡萄糖苷酶的原位浓缩与回收；(v) 研究重组β-葡萄糖苷酶的水解性能。
部分内容摘录
菌株、试剂和培养基
大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株在实验室中于-80°C保存用于质粒复制。Pichia pastoris KM71(his4)菌株购自Coolaber Science & Technology Co., Ltd.（北京）。实验中使用的所有酶均来自Takara Holdings Inc.（北京）。其他试剂详见支持信息部分1。P. pastoris的质粒构建与转化
本研究使用了编码β-葡萄糖苷酶（Glu）的氨基酸序列。GB标签是一种特定的氨基酸序列
在Pichia pastoris中筛选高表达转化子
在本研究中，将GB标签通过柔性连接肽（GGGGS）3连接到台湾白蚁来源的β-葡萄糖苷酶基因序列上。GB标签（HNWYHWWPH）具有增强表面吸附性的疏水性。为适应Pichia pastoris的密码子偏好，对重组蛋白序列进行了优化，设计了重组基因GLGB。在GLGB的N端插入了EcoRI消化位点，并添加了NotI消化位点
结论
我们开发了一种结合半连续批次发酵与泡沫分离的方法，用于从发酵液中原位浓缩和回收重组β-葡萄糖苷酶。首先研究了5 L发酵罐中重组β-葡萄糖苷酶生产的最佳操作条件；随后进行了半连续补料批次发酵，探讨了发酵时间和批次对酶产量的影响
CRediT作者贡献声明
赵成利：撰写初稿、方法学设计、实验实施、概念构思。李青：数据验证、方法学设计、实验实施、数据分析。杨帆：数据验证、方法学设计、实验实施。马新楠：方法学设计、数据分析。吴家聪：方法学设计、数据分析。韩娟：撰写、审稿与编辑、实验监督、资金获取、概念构思。王磊：实验监督、资源调配。王云：撰写、审稿与编辑、实验监督、资金获取
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢国家自然科学基金（编号：22278191）的财政支持。
