《Metabolic Engineering》：A metabolizable inducer–based carbon-source autoinduction (MICA) system enables low-cost, high-level protein expression and metabolic control in
Bacillus subtilis
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本研究开发了一种代谢可诱导的碳源自诱导系统（MICA），通过优化六种内源碳源响应调控模块（麦芽糖、甘露糖等），结合T7 RNA聚合酶放大和葡萄糖碳源复压制（CCR）动态调控，实现了高效可控的蛋白表达与代谢调控。在摇瓶中，最佳变体PT7malA1的番茄红素和β-胡萝卜素产量分别达82.5和94.2 mg/L，较对照组提升4.5倍和6.3倍；3L生物反应器中β-胡萝卜素产量提升至244.7 mg/L，创B. subtilis最高记录。MICA系统为低成本、高 scalability的工业生物技术应用提供了新平台。
杨莉|李振东|林玉峰|吴耀康|徐先浩|张艳|吴业旭|刘彦峰|李江华|杜国成|吕学勤|陈健|刘龙
教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，江南大学，中国无锡214122
摘要
枯草芽孢杆菌因其稳定性、安全性以及强大的分泌能力而被广泛用于工业蛋白质生产和代谢合成。然而，高成本和细胞毒性的化学诱导剂仍然是大规模生物工艺的主要瓶颈。在这里，我们开发了基于可代谢诱导剂的碳源自诱导（MICA）系统，该系统利用了枯草芽孢杆菌中的六个内源性、廉价、无毒且可代谢的碳源响应调节模块——麦芽糖、甘露糖、山梨醇、阿拉伯糖、木糖和甘油。首先，系统的启动子工程显著增强了这六个调节模块的表达强度。其次，T7 RNA聚合酶系统的整合进一步放大了它们的输出能力，提高了诱导敏感性，并降低了诱导剂的消耗。第三，通过利用葡萄糖介导的碳代谢物抑制（CCR）机制，麦芽糖和甘露糖系统具备了可编程的自诱导行为，通过简单调节葡萄糖浓度可以在可调的时间点进行诱导。最后，MICA系统被应用于碱性蛋白酶和β-1,3-葡聚糖的高水平生产，以及番茄红素和β-胡萝卜素生物合成的动态调控。值得注意的是，表现最佳的变体PT7malA1在摇瓶培养中产生了82.5毫克/升的番茄红素和94.2毫克/升的β-胡萝卜素，分别比Pgrac对照组提高了4.5倍和6.3倍。当放大到3升生物反应器时，β-胡萝卜素的浓度进一步达到了244.7毫克/升，这是迄今为止在枯草芽孢杆菌中报道的最高水平。总体而言，MICA系统提供了一个多功能、低成本且无毒的平台，用于强大的蛋白质过表达和动态代谢调控，具有广阔的工业生物技术应用潜力。
引言
诱导型基因表达系统是代谢工程和合成生物学中的基础工具，因为它们可以以时间和剂量依赖的方式精细调节基因表达（English等人，2021年）。与组成型表达系统相比，诱导型系统允许动态调节基因表达，从而减少代谢负担，提高细胞活力，并增强重组蛋白、增值化学品和生物聚合物的合成（Meyer等人，2019年；Tominaga等人，2021年）。这类系统也是构建复杂遗传电路不可或缺的组成部分，包括切换开关（Gardner等人，2000年）、振荡器（Elowitz和Leibler，2000年；Potvin-Trottier等人，2016年；Stricker等人，2008年）和逻辑门（Bonnet等人，2013年），这些电路需要明确定义的开启/关闭行为和可调的诱导动力学。因此，诱导型系统的性能、成本和可扩展性直接影响了大规模生物工艺的可行性。
枯草芽孢杆菌由于其公认的安全性（GRAS）状态、强大的蛋白质分泌能力和无内毒素特性，已成为工业生物技术的稳健且安全的底盘（Zhang等人，2020年）。它被广泛用于酶生产、抗菌肽合成和合成生物学应用（Li等人，2022年；Mao等人，2021年）。与已建立的模型宿主如大肠杆菌和酿酒酵母相比，枯草芽孢杆菌仍然缺乏适用于大规模操作的多功能和高性能诱导系统（Sathesh-Prabu等人，2024年；Wang等人，2023年）。许多现有的系统源自天然调节电路或直接从其他生物体适应而来，通常存在诱导强度不足、基础泄漏显著、与富含葡萄糖的培养基不兼容或在生物反应器中可扩展性差等问题（Ike等人，2015年；Li等人，2025年；Seo和Schmidt-Dannert，2019年）。这些限制限制了现代合成生物学应用所需的精确度和灵活性。
在枯草芽孢杆菌中，已经建立了几种用于研究和工业应用的诱导系统。广泛使用的异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）和无水四环素（aTc）响应启动子可以支持强而快速的诱导（Li等人，2025年；Phan等人，2015年）；然而，它们的使用通常需要相对昂贵的诱导剂，需要仔细控制诱导时间，并且经常表现出泄漏表达，这在生产有毒蛋白质时尤其成问题。除了这些化学触发系统外，还开发了基于代谢物响应的调节电路以实现基于细胞内代谢状态的自主控制。一个典型的例子是葡萄糖胺-6-磷酸（GlcN6P）响应的生物传感器与成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）干扰技术相结合（Wu等人，2020a）。这类系统提供了自我调节的功能，但本质上受到所检测代谢物特异性的限制，因此仅适用于直接涉及相应代谢中间体的途径（Wu等人，2020a）。另一组系统依赖于碳水化合物诱导启动子。例如，甘露糖诱导的PmanP系统可以实现高效的蛋白质生产，尽管其在更复杂的代谢工程中的应用受到限制（Wenzel等人，2011年）。同样，如PmalA这样的麦芽糖诱导启动子已经得到了优化，但其性能往往受到相对较低表达输出的限制（Ming等人，2010年）。因此，尽管枯草芽孢杆菌中存在许多诱导启动子，但由于效率低、表达特性不灵活或与工业发酵环境兼容性差，大多数尚未得到广泛改进或应用，这突显了需要一个更系统化和可扩展的诱导表达框架的必要性。
在这项研究中，我们开发了基于可代谢诱导剂的碳源自诱导（MICA）系统，这是一个基于枯草芽孢杆菌中六个内源性和可代谢的碳源响应模块的统一诱导表达架构。我们首先建立了一个启动子优化模块来增强诱导强度，减少基础泄漏，并定量定义所有六个系统的调节参数。然后，我们加入了基于T7 RNA聚合酶的放大模块，以进一步提高最大转录输出并增加诱导敏感性，同时降低诱导剂的需求。最后，通过利用葡萄糖介导的CCR原理，我们在麦芽糖和甘露糖平台上设计了动态代谢开关。这种架构允许系统在最佳时间点自我触发表达阶段，完全由主要碳源的消耗量控制，而不需要外部干预。由此产生的MICA框架被应用于碱性蛋白酶和β-1,3-葡聚糖的高水平生产，以及番茄红素和β-胡萝卜素生物合成的动态调控。总体而言，这项工作建立了一个模块化、可调且成本效益高的诱导表达平台，支持枯草芽孢杆菌中的强大蛋白质生产和可扩展的代谢工程。
化学物质和试剂
除非另有说明，所有化学物质均从Sangon Biotech（中国上海）购买。包括麦芽糖、甘露糖、山梨醇、阿拉伯糖、木糖和甘油在内的碳水化合物底物由Yuanye Bio-Technology（中国上海）提供。质粒制备和DNA纯化试剂盒以及限制性内切酶来自Thermo Scientific（美国沃尔瑟姆）。PrimeSTAR HS DNA聚合酶来自Takara Biomedical Technology（中国北京）。
基于可代谢诱导剂的碳源自诱导（MICA）系统的设计
为了开发适用于工业规模代谢控制的诱导表达系统，必须满足几个基本标准。该系统必须无毒，并且所使用的诱导剂不应阻碍生物量积累或干扰中心代谢。诱导剂应价格低廉且适用于大规模发酵，避免像IPTG这样的化学诱导剂所带来的高成本和毒性。调节模块应表现出低的基础泄漏、高最大输出等特性。
讨论
在这项研究中，我们建立了枯草芽孢杆菌中的MICA系统，这是一个统一的诱导表达框架。首先，我们通过工程改造调节元件增强了MICA的诱导强度并减少了基础泄漏。其次，T7 RNAP层进一步放大了表达并提高了诱导敏感性，从而减少了诱导剂的用量。最后，基于CCR的自诱导机制允许通过简单调节初始葡萄糖水平来程序化控制诱导时间。
CRediT作者贡献声明
林玉峰：研究、数据分析。吴耀康：方法学、研究。陈健：监督、项目管理。杨莉：撰写——初稿、研究、数据分析。刘龙：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、概念构思。李振东：方法学、研究、数据分析。杜国成：监督、项目管理。吕学勤：撰写——审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理。
资助
这项工作得到了中国国家重点研发计划（2025YFC3409402）、江苏省基础研究计划（BK20253060）、中国教育部的基础与跨学科学科突破计划（JYB2025XDXM503）、中央高校的基本研究经费（JUSRP202404017、JUSRP622004）、江苏省合成生物学基础研究中心（资助编号BK20233003）以及研究生研究与实践的资助。
