《Metabolic Engineering》：Rewiring methanol metabolism in
Komagataella phaffii through implementation and evolution of a heterologous RuMP cycle
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本研究旨在解决天然巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)甲醇同化途径(XuMP循环)能效偏低的问题。研究人员通过在该酵母中敲除XuMP循环，并引入细菌来源的RuMP循环，首次构建了完全依赖异源RuMP循环生长的工程菌株(RuMPi)，并通过多拷贝整合和适应性实验室进化(ALE)将其比生长速率提升了约4倍。结果表明，在低比生长速率下，优化后的工程菌RuMPi_mc_fba-ta_evo可获得与野生型相当的生物量得率和甲醇消耗率。该工作证明了在天然甲基营养酵母中替换同化途径的可行性，为优化甲醇生物制造提供了新策略。
在追求可持续发展的生物制造过程中，寻找不与人争粮的替代碳源至关重要。甲醇，作为一种廉价、易得、高度还原的一碳化合物，展现出巨大的潜力。天然的甲基营养微生物，如巴斯德毕赤酵母(Komagataella phaffii)，是甲醇生物加工的优良宿主。然而，其自身用于同化甲醇的木酮糖单磷酸(XuMP)循环，在能量消耗上“大手大脚”——它需要消耗3个ATP分子才能产生1个甘油醛-3-磷酸，而细菌中常见的核酮糖单磷酸(RuMP)循环完成同样的任务只需1个ATP。这种能量效率上的差异，限制了基于甲醇的生物过程的成本效益。为了“开源节流”，提升甲醇代谢的能效，科学家们将目光投向了为酵母“换芯”，即用细菌的高效RuMP循环替换其固有的XuMP循环。这项发表在《Metabolic Engineering》上的研究，首次在巴斯德毕赤酵母中成功关闭了其天然甲醇同化通路，并完全依靠一个外来的RuMP循环实现了在甲醇上的生长。这不仅是一次大胆的代谢途径“移植手术”，更为我们理解在复杂真核细胞中重构核心代谢网络提供了宝贵范例。
研究人员开展本研究主要运用了以下关键技术方法：1. CRISPR-Cas9基因编辑：用于精确敲除巴斯德毕赤酵母中的关键内源基因（DAS1、DAS2、SHB17），并引入异源基因。2. Golden Gate克隆：用于构建包含异源基因表达盒和CRISPR-Cas9组件的质粒。3. 适应性实验室进化(ALE)：将工程菌株在甲醇为唯一碳源的条件下进行多代连续传代培养，以筛选获得生长速率提升的突变体。4. 化学恒化器连续培养：在恒定稀释率下精确测定工程菌株与野生型在甲醇上的生物量得率、底物消耗速率等生理参数。5. 全基因组测序(WGS)：结合Illumina测序平台对进化后菌株进行测序，通过变异检测识别与表型改善相关的基因突变。6. 流式细胞术：通过碘化丙啶(PI)染色分析细胞活力。7. 通量平衡分析(pFBA)：利用COBRApy工具和基因组尺度代谢模型(iMT1026v3)，从理论上分析RuMP循环与XuMP循环的ATP消耗差异。
研究结果
1. XuMP循环被重连至RuMP循环。
为了在巴斯德毕赤酵母中将XuMP循环重连为RuMP循环，研究人员敲除了二羟基丙酮合酶基因DAS1和DAS2，并引入了来自Bacillus methanolicus的两种关键异源酶：3-己酮糖-6-磷酸合酶(Hps)和6-磷酸-3-己酮糖异构酶(Phi)。通过融合过氧化物酶体靶向信号(PTS1)，将这些酶定位到过氧化物酶体中。为确保核酮糖-5-磷酸(Ru5P)的再生，内源的转酮醇酶1(Tkl1)也被过表达并靶向同一细胞器。由此构建的工程菌株被命名为RuMPi_fba-mix，成功建立了异源RuMP循环。此外，还构建了一个Hps和Phi不携带PTS1标签（定位于细胞质）的菌株RuMPi-c，用以评估途径在过氧化物酶体外的功能。
2. 敲除Shb17启用RuMP循环的FBA/TA变体。
在巴斯德毕赤酵母中，天然存在景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(Shb17)和转醛缩酶(Tal)，这导致RuMPi_fba-mix菌株中同时存在RuMP循环的两种变体：果糖-1,6-二磷酸醛缩酶/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(FBA/SBP)变体和果糖-1,6-二磷酸醛缩酶/转醛缩酶(FBA/TA)变体。其中，FBA/TA变体是能效最高的构型。为特异性地启用该变体，研究人员敲除了催化景天庚酮糖-1,7-二磷酸(S1,7BP)向景天庚酮糖-7-磷酸(S7P)转化的SHB17基因，得到新菌株RuMPi_fba-ta。
3. RuMP循环的过氧化物酶体定位是甲醇作为唯一碳源生长的必要条件。
过氧化物酶体定位的两种RuMPi菌株（RuMPi_fba-mix和RuMPi_fba-ta）能够在以1%甲醇为唯一碳源的基本培养基中生长，其比生长速率μ = 0.007 ± 0.001 h-1。而细胞质定位的RuMPi-c菌株则无法维持生物量生产，表明过氧化物酶体的区室化对于处理有毒中间体甲醛、平衡同化与异化代谢流至关重要。
4. 引入Hps和Phi的多拷贝及提高培养温度可加速生长。
通过增加异源基因HPS和PHI的拷贝数，菌株的比生长速率得到提升。RuMPi_fba-mix的最佳克隆拷贝数为6 ± 1，μ提升至0.010 h-1；RuMPi_fba-ta的最佳克隆拷贝数为13 ± 4，μ提升至0.015 h-1。此外，将培养温度从25°C提高到30°C，能使比生长速率提高约1.2倍，这可能是由于提高了源自嗜热细菌的Hps和Phi的酶活性。这些多拷贝菌株被命名为RuMPi_mc_fba-mix和RuMPi_mc_fba-ta，并作为适应性实验室进化(ALE)的起始菌株。
5. 适应性实验室进化提高了RuMPi的比生长速率。
研究人员对多拷贝菌株进行了ALE。在25°C下进化14代（约60代）后，RuMPi_mc_fba-mix_evo1的比生长速率提升至μ = 0.022 ± 0.001 h-1。随后在30°C下进一步进化，RuMPi_mc_fba-mix_evo2达到μ = 0.031 ± 0.001 h-1，RuMPi_mc_fba-ta_evo达到μ = 0.030 ± 0.001 h-1。实时定量PCR分析显示，进化后菌株的HPS和PHI拷贝数均稳定在10个左右，暗示了该拷贝数可能是最优的。ALE使工程菌株的生长速率提升了约4倍。
6. 全基因组测序表明RuMPi_mc_fba-mix_evo1中PKP1-2发生截断。
对RuMPi_mc_fba-mix_evo1菌株进行全基因组测序，发现在五个独立克隆中，均存在导致丙酮酸脱氢酶复合物负调节因子1-2(Pkp1-2)基因截断的单核苷酸多态性(SNP)。该截断可能导致Pkp1-2失活，从而解除其对丙酮酸脱氢酶(PDH)复合物的抑制，可能增加了乙酰辅酶A和NADH+H+的供应，有利于平衡能量和碳代谢流。然而，将该截断引入亲本菌株仅能部分再现生长速率的提升，表明还存在其他有益突变。
7. 化学恒化器培养显示在低稀释率下生物量得率与野生型相当。
在化学恒化器中，研究人员评估了进化菌株在不同稀释率（D，即比生长速率μ）下的性能。在D = 0.035 h-1时，RuMPi_mc_fba-mix_evo1的生物量得率(YX/S，0.38 g g-1)和比甲醇消耗速率(qS，0.09 g g-1h-1)与野生型相当。对RuMPi_mc_fba-ta_evo在四个稀释率（0.02-0.05 h-1）下的测试表明，在低稀释率（0.02和0.03 h-1）下，其性能与野生型相似。然而，在更高的稀释率下，其生物量得率显著下降，比甲醇消耗速率呈指数上升，且细胞活力下降。这表明工程菌株在接近其最大生长速率时承受了更高的代谢压力。
8. 简约通量平衡分析显示RuMPi菌株的理论能量需求更低。
利用通量平衡分析(pFBA)对野生型和RuMPi_fba-ta菌株的理论能量需求进行估算。在所有测试的甲醇消耗速率下，RuMPi菌株用于生物量形成的比ATP消耗率（生长相关维持，GAM）仅为野生型的0.8-0.9倍，这主要归因于RuMP循环避免了二羟基丙酮激酶(Dak2)的消耗。然而，考虑到总ATP成本，RuMPi菌株的预测总ATP需求反而比野生型高1.1-1.2倍。这解释了为何实验观察到的生物量得率并未体现RuMP循环的理论优势，也突显了体内代谢调控的复杂性。
9. 甲醇毒性筛选显示细胞活力未降低。
在甲醇浓度1%-6%范围内，RuMPi_mc_fba-ta_evo和野生型均能生长，但工程菌株的延迟期更长，比生长速率更低。即使在最高测试浓度下，细胞活力也未显著降低。这表明在化学恒化器中观察到的活力下降并非由过高甲醇浓度直接导致，而更可能与高比生长速率下多种胁迫因素叠加有关。
10. 在进化菌株中过表达Tpi1未能进一步改善生长。
在RuMPi_mc_fba-ta_evo菌株中过表达内源的三碳糖磷酸异构酶(Tpi1)未能带来额外的生长优势，表明主要的瓶颈可能仍在于异源酶Hps和Phi的性能，或整体代谢网络的平衡。
结论与讨论
本研究表明，在巴斯德毕赤酵母中用RuMP循环完全替代其天然的XuMP循环是可行的。工程菌株RuMPi能够在甲醇上生长，并通过ALE，其比生长速率从初始的0.007 h-1提升至0.030 h-1，实现了约4倍的改善。在低比生长速率下，优化后的工程菌株在生物量得率和甲醇消耗率上可达到与野生型相当的水平，这证明了异源途径的初步功能整合是成功的。
然而，研究也揭示了诸多挑战。工程菌株的最大比生长速率仍显著低于野生型（0.07 h-1），并且在更高稀释率下出现生物量得率下降和代谢压力增加的现象。尽管RuMP循环在理论上具有更高的ATP效率，但实际的代谢通量分析(pFBA)和实验数据均表明，工程菌株的总ATP负担反而更重，且未能在生物量得率上展现出预期优势。这凸显了在活体细胞内，孤立途径的理论能效优势可能被全局性的代谢调控、酶动力学限制、区室化效率以及辅因子平衡等复杂因素所抵消。对丙酮酸脱氢酶复合物负调节因子Pkp1-2截断突变体的发现，暗示了优化中心代谢节点（如乙酰辅酶A供应）对于支持新的代谢网络具有重要意义。
研究人员特别指出，异源酶Hps和Phi的性能是一个关键限制因素。这些酶源自最适生长温度在50-55°C的嗜热细菌，而在30°C的酵母培养条件下，其活性可能严重不足。未来的优化方向可以包括对这些酶进行蛋白质工程改造以提高其在常温下的活性，或筛选来自中温菌的更适配同源酶。此外，系统的组学分析（如转录组、蛋白组、代谢组）将有助于全面识别代谢瓶颈和应激反应，指导进一步的理性设计。
这项工作的意义在于，它超越了以往在天然甲基营养菌中“叠加”途径的策略，首次实现了对核心甲醇同化通路的彻底“替换”。这不仅为构建更高效的甲醇细胞工厂提供了一条全新路径，也作为一个模型系统，深刻揭示了在真核宿主中重构基础代谢网络时所面临的能量平衡、代谢流重定向和全局适应等根本性挑战。尽管前路仍有障碍，但本研究无疑为理解和驾驭微生物的代谢可塑性，以服务于可持续的生物制造，迈出了坚实而富有启发性的一步。
