《ACS Synthetic Biology》：Benzylisoquinoline Alkaloid Production in Yeast via Norlaudanosoline Improves Titer, Selectivity, and Yield
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本研究报道了一项在酵母中通过去甲劳丹碱（(S)-norlaudanosoline）途径，而非传统的去甲乌药碱（(S)-norcoclaurine）途径，合成苄基异喹啉生物碱（BIAs）的创新策略。该策略利用人单胺氧化酶A（MAO）合成关键醛中间体3,4-二羟基苯乙醛（3,4-dHPAA），有效规避了酵母Ehrlich途径中Aro10酶的底物混杂性问题，大幅减少了副产物生成。优化的酵母菌株在补料分批发酵中实现了4.8 g/L的(S)-网脉碱（(S)-reticuline）产率和24 mg/g蔗糖的得率，并将产物选择性提升至83%。进一步延伸该途径，成功实现了对二氢血根碱（dihydrosanguinarine）和血根碱（sanguinarine）的高效从头合成，产量高达635 mg/L，较先前报道提升了40倍。这项工作展示了通过重编程代谢通路提升微生物细胞工厂生产高价值植物天然产物的效率、特异性和经济可行性的潜力。
摘要
苄基异喹啉生物碱（BIAs）是一类重要的植物天然产物，在医药和农业领域应用广泛。本研究在酿酒酵母中，从简单的蔗糖原料出发，成功构建了通过去甲劳丹碱（(S)-norlaudanosoline）中间体，而非经典的去甲乌药碱（(S)-norcoclaurine）中间体，合成关键分支点BIA (S)-网脉碱（(S)-reticuline）的新途径。新途径的核心是利用人单胺氧化酶A（MAO）从多巴胺合成3,4-二羟基苯乙醛（3,4-dHPAA），替代了由酵母自身Ehrlich途径酶Aro10生成的4-羟基苯乙醛（4-HPAA）。这一改变显著提高了途径的选择性和效率。在优化的菌株和发酵条件下，实现了4.8 g/L的(S)-网脉碱产率，得率达到24 mg/g蔗糖，且产物选择性高达83%，较之前通过4-HPAA的途径在产量、得率和选择性上均有显著提升。进一步将从头合成的(S)-网脉碱延伸至二氢血根碱（dihydrosanguinarine）和血根碱（sanguinarine），在补料分批发酵中获得了635 mg/L的总产量，较先前微生物生产水平提高了40倍。该研究为高效、特异性地利用微生物生产具有商业价值的复杂植物生物碱提供了新策略。
引言
苄基异喹啉生物碱（BIAs）是四氢异喹啉（THIQs）家族中的一大类植物次生代谢产物，包括吗啡、可待因、罂粟碱等药物，以及血根碱、白屈菜红碱等抗生素。尽管部分BIAs可从植物中提取以满足商业化需求，但微生物合成因其原料廉价、遗传操作性强、易于放大等优点，成为获取更多BIA家族成员的有吸引力的选择。此前，研究者已在酵母中实现了4.6 g/L的(S)-网脉碱（BIA合成通路的关键分支点）的从头合成，该途径依赖Ehrlich途径的2-氧酸脱羧酶Aro10来生成中间体4-HPAA。然而，Aro10和后续植物酶（如去甲乌药碱合酶NCS）的底物混杂性导致多种非目标THIQs副产物的生成，影响了目标产物的纯度和效率。
结果
额外拷贝BIA修饰基因减少通路中间体积累
在前期高产(S)-网脉碱的酵母菌株LP507中，尽管效价可观，但质谱分析显示，(S)-网脉碱仅占总THIQs离子流图的42%，另有25%为上游BIA通路中间体（如(S)-去甲乌药碱、(S)-乌药碱等），33%为多巴胺与苯乙醛（PAA）缩合生成的4‘-未取代苄基-THIQ副产物。为提升(S)-网脉碱的合成，研究者首先在菌株LP524中引入了通路基因6OMT、CNMT和NMCH的额外拷贝，使得上游BIA中间体的相对丰度从25%降至18%，但4’-未取代苄基-THIQ副产物仍占33%。
敲除ARO10最小化从头合成4'-脱羟基去甲乌药碱
鉴于4’-未取代苄基-THIQ主要源于NCS催化多巴胺与PAA的缩合，而PAA的主要合成酶被认为是Aro10。因此，研究者敲除了菌株LP524中的内源和过表达的ARO10，构建了菌株LN1002。结果显示，该菌株的(S)-网脉碱产量下降了90%，但多巴胺积累量大幅增加至3.1 g/L，并且4’-未取代苄基-THIQ副产物几乎完全消失，证实了Aro10是PAA和4-HPAA合成的主要贡献者，同时也导致了菌株生长抑制。
在ARO10敲除菌株中表达MAO恢复BIA合成
在清除了Aro10和大量副产物的LN1002菌株基础上，研究者探索了利用MAO从多巴胺合成3,4-dHPAA，进而与多巴胺缩合形成去甲劳丹碱的替代通路。将密码子优化的人MAO（HsMAO-A）基因在四种不同强度的启动子下导入LN1002。结果表明，MAO的表达成功降低了多巴胺水平，生成了3,4-dHPAA的还原产物羟基酪醇，并恢复了(S)-网脉碱的合成，证实了去甲劳丹碱途径在酵母中的可行性。然而，MAO的过表达会降低菌株的最大比生长速率，移除MAO的C端跨膜结构域（MAOΔTM）虽可恢复生长速率，但其酶活也相应降低。
以pTEF2启动子驱动MAO在补料分批发酵中限制脱靶四氢异喹啉合成
在补料分批发酵中，表达MAO的菌株LN1047（使用pTEF2启动子）生产了4.0 g/L (S)-网脉碱，非目标4’-未取代苄基-THIQ仅占5%，(S)-网脉碱选择性达到80%。这证明了通过3,4-dHPAA的BIA合成有效减少了脱靶缩合产物。然而，发酵液中仍积累了3.2 g/L羟基酪醇、0.16 g/L 3,4-二羟基苯乙酸（3,4-dHPAC）和0.44 g/L多巴胺，表明前体平衡和醛中间体分流问题仍需优化。
平衡通路分支点酶的表达增强去甲劳丹碱合成
为优化前体多巴胺和3,4-dHPAA的平衡，研究者测试了酶活降低的MAOΔTM-p变体，以及使用更弱启动子驱动野生型MAO。结果显示，使用pRPL18B启动子的菌株LN1063产出了4.25 g/L (S)-网脉碱，但多巴胺积累仍较高。通过筛选转录组数据，找到了强度介于pRPL18B和pTEF2之间的启动子pRPS23A。使用该启动子驱动MAO，并引入额外一份过氧化物酶体靶向的NCS拷贝，构建了菌株LN1069。在补料分批培养中，LN1069实现了4.8 g/L的(S)-网脉碱产量，得率为24 mg/g蔗糖，产物选择性达83%，上游BIA中间体和4‘-未取代副产物分别占12%和5%。
通过(S)-去甲劳丹碱从头合成二氢血根碱
在成功构建去甲劳丹碱途径产(S)-网脉碱的菌株LN1015基础上，研究者进一步引入了从(S)-网脉碱到二氢血根碱的六步酶促通路。通过逐步引入小檗碱桥酶（BBE）、(S)-齐兰叶堇碱合酶（CFS）、(S)-斯氏紫堇碱合酶（SPS）、(S)-四氢原小檗碱N-甲基转移酶（TNMT）、(S)-N-甲基斯氏紫堇碱羟化酶（MSH）和原阿片碱6-羟化酶（P6H），最终构建了可从头合成二氢血根碱的酵母菌株LN1084。其中，BBE是通路中的主要限速步骤。在补料分批发酵中，菌株LN1084合成了572 mg/L二氢血根碱和63 mg/L血根碱，总计635 mg/L。此外，还积累了2.2 g/L (S)-网脉碱和87 mg/L原阿片碱。质谱分析还发现了推测为hunemanine和izmirine的副产物，这源于TNMT和MSH酶的脱靶活性。
讨论
本研究将酵母中(S)-网脉碱的合成途径从依赖Ehrlich途径的去甲乌药碱路线，重编程为依赖MAO的去甲劳丹碱路线。新途径在产量、得率和选择性上均优于旧途径，实现了更高效、特异的BIA生产。研究凸显了酶底物混杂性在异源通路构建中的挑战与机遇，以及平衡宿主代谢与异源通路、精细调控分支点酶表达的重要性。通过延伸通路成功高产二氢血根碱，证明了该酵母平台生产商业化BIA的潜力。未来工作可集中于通过辅因子工程、酶定位、动态调控等策略，进一步减少副产物积累、回收流失碳流，并克服生长抑制，以实现BIA微生物生产的完全商业化。
