《Bioconjugate Chemistry》：A Cysteine-Specific Cationization Strategy for Versatile Antibody Production against Intrinsically Disordered Proteins
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本文介绍了一种创新的半胱氨酸特异性S-阳离子化化学修饰策略，用以解决因富含固有无序区域（IDR）而易于聚集的自身抗原的生产难题。该策略能将不溶的变性蛋白转化为可溶形式，从而生产出全长、水溶性的抗原。利用这些抗原免疫兔子，可获得高亲和力、主要识别线性表位的多克隆抗体。这些抗体不仅能有效结合天然构象的细胞内靶蛋白，还能作为高质量阳性对照，用于验证基于Luminex磁珠的多重自身抗体检测（MUSCAT）平台。该研究为开发针对不稳定蛋白的抗体和诊断应用提供了可靠且标准化的新方法。
简介
免疫系统通过维持对自身抗原的耐受来防止自身免疫疾病的发生。然而，在自身免疫病和癌症中，这种稳态被打破，导致产生靶向多种自身蛋白的自身抗体。这些自身抗体是重要的生物标志物，在临床诊断中具有稳定性高的优势。然而，许多关键的自身抗原，特别是那些与抗肿瘤免疫反应相关的，往往富含固有无序区域（IDR），这种特性导致它们在重组表达、纯化和储存过程中极不稳定并易于聚集，这为生产全长、高纯度的抗原带来了巨大挑战，也限制了基于多重自身抗体检测的诊断平台发展。
结果
针对S-阳离子化抗原的多克隆抗体识别天然IDR富集蛋白上的线性表位
研究团队从多重S-阳离子化抗原固定化磁珠（MUSCAT）检测面板中选取了47种代表性自身抗原。这些抗原在大肠杆菌中多以包涵体形式表达。通过采用半胱氨酸（Cys）特异性S-阳离子化（使用TAPS-磺酸盐）技术，成功将这些不溶性蛋白溶解并纯化出来。生物信息学分析预测，这47种抗原大多富含固有无序区域，其中33种是易于在哺乳动物细胞中聚集的癌症睾丸抗原（CTA）。
用这47种S-阳离子化抗原分别免疫兔子后，通过酶联免疫吸附测定和蛋白质印迹法均确认产生了抗原特异性的抗体反应。通过抗原亲和层析柱纯化获得的多克隆抗体，能够在非变性条件下，从肺癌细胞系裂解液中有效免疫沉淀内源性表达的NY-ESO-1和XAGE-1b等CTA，也能捕获瞬时表达的p53、WT-1和LUZP4蛋白。这些结果表明，针对S-阳离子化变性抗原产生的抗体能够识别细胞内抗原的天然构象，这可能是因为这些自身抗原构象灵活、富含IDR，即使在天然状态下也能暴露出线性表位，从而使抗体能够有效结合线性序列。
使用对照抗体对MUSCAT检测进行验证分析
研究使用47种抗原特异性抗体验证了抗原固定化Luminex磁珠的质量。结果显示，对照抗体与抗原固定化磁珠的结合具有浓度依赖性，其解离常数（Kd）在0.1-3.3 nM之间，显示了高亲和力。MUSCAT检测平台表现出较低的板内（重复孔间）和板间（不同天之间）变异，当荧光中位强度（MFI）值超过一定范围时，其变异系数可分别低于10%和约20%，符合诊断应用的通用标准。此外，通过标准曲线拟合能够准确估计抗体浓度，且不同批次的S-阳离子化抗原固定化磁珠制备具有高度可重复性2). (D) Reproducibility of the MUSCAT assay signal was verified by comparing two independent lots of antigen-immobilized beads. Data are presented as the mean and standard deviation (error bars) of the MFI values (LLOQ ≤ MFI ≤ ULOQ) obtained from triplicate measurements at the positive control antibody dilution for each lot.">。这些数据证明了该检测方法的高精度、宽动态范围和良好的可重复性。
S-阳离子化对抗体结合和表位识别的影响
为了评估化学修饰对抗体特异性的影响，研究比较了抗体对S-阳离子化抗原、原始免疫原以及还原型非阳离子化抗原的结合情况。蛋白质印迹分析表明，所有抗体对S-阳离子化抗原和还原型抗原的结合几乎相同，这表明抗体主要识别的是线性表位。对印迹条带强度的定量分析显示，还原型与非还原型抗原的信号比值（R/NR）存在微小差异，表明S-阳离子化修饰在较高R/NR比值时会轻微干扰抗体结合，反之，在较低比值时，免疫过程中可能产生了一小部分特异性识别S-阳离子化修饰基团的抗体。
针对S-阳离子化抗原产生的抗体的脱靶分析
研究人员进一步考察了针对S-阳离子化修饰基团（四甲基铵丙基二硫化物）的免疫反应。蛋白质印迹结果显示，未经修饰的天然牛血清白蛋白（BSA）不与抗S-阳离子化抗原的抗体发生反应，而S-阳离子化的BSA则对所有测试抗体都显示出免疫反应条带，证实了抗体能够识别添加的修饰基团。在还原条件下，由于修饰基团解离，免疫反应条带消失。使用不同化合物进行的修饰实验进一步表明，抗体能够精确区分季铵基团和连接化学键的性质，例如，抗体只识别由TAPS-磺酸盐修饰的抗原，而不识别其S-烷基化版本（TAP-Br）或其他铵丙基修饰的抗原。在MUSCAT检测中评估交叉反应性时发现，高亲和力的线性表位特异性抗体主要结合抗原固定化磁珠，而对通用修饰表位的结合对检测验证的影响可以忽略不计。
讨论
经典的体液免疫反应针对的是血液或细胞外液中稳定的构象表位。然而，自身免疫和抗肿瘤反应通常由细胞凋亡释放的细胞内自身抗原触发，这些抗原富含IDR，导致产生的自身抗体更倾向于识别线性表位。IDR富集蛋白的聚集倾向是重组表达和纯化的主要障碍。S-阳离子化技术通过特异性修饰蛋白质中所有半胱氨酸残基的巯基，引入正电荷，成功将不溶的变性蛋白转化为水溶性形式，从而能够利用反相高效液相色谱（HPLC）进行高效纯化。这种方法为生产全长、水溶性的自身抗原提供了一种可靠的方案。
本研究证明，用S-阳离子化抗原免疫兔子可以产生可靠的多克隆抗体。这些抗体经亲和纯化后，在蛋白质印迹、免疫沉淀等多种生化应用中表现有效，并能结合细胞裂解液中处于天然状态的靶抗原。利用这些抗体，可以高质量地验证MUSCAT检测中抗原固定化磁珠的性能。尽管免疫过程会产生一小部分针对S-阳离子化半抗原的抗体，但这部分抗体不影响MUSCAT检测的验证，必要时可通过TAPS-BSA亲和柱去除。总之，S-阳离子化方法为生产用于免疫和自身抗体检测的稳定抗原，特别是针对富含IDR的自身抗原，提供了一种可靠策略，并生成了用于检测验证的高质量对照抗体，有助于克服生物标志物开发中的长期技术挑战，推动免疫肿瘤学中液体活检工具的发展。
实验方法
S-阳离子化试剂合成：合成了关键的化学修饰试剂TAPS-磺酸盐和APS-磺酸盐。
重组抗原制备：将47种抗原的cDNA克隆到表达载体中，在大肠杆菌中表达为不溶性包涵体。包涵体溶解于高浓度变性剂后，用TAPS-磺酸盐进行可逆的S-阳离子化修饰。去除变性剂后，通过反相HPLC纯化得到水溶性抗原。
IDR预测：使用IUPred3、DISOPRED3和PONDR-VSL2三种工具预测了蛋白质的固有无序区域。
免疫与抗体纯化：由合作公司用每种S-阳离子化抗原免疫兔子产生抗血清。通过硫酸铵沉淀和辛酸处理初步纯化IgG，随后用His-EGFP-Strep-tag II融合蛋白亲和柱去除抗标签抗体，最后用对应的TAPS修饰抗原亲和柱纯化抗原特异性抗体。
蛋白质印迹与免疫沉淀：通过蛋白质印迹分析抗体特异性。在非变性条件下，使用纯化的多克隆抗体从细胞裂解液中免疫沉淀内源性或瞬时表达的靶蛋白。
MUSCAT检测：将纯化的抗原和TAPS-BSA共价偶联到Luminex磁珠上。将系列稀释的抗体样品与磁珠孵育，洗涤后使用藻红蛋白标记的二抗检测，通过Bio-Plex200系统读取荧光中位强度（MFI）信号。对检测的动态范围、线性、精密度以及不同批次磁珠的一致性进行了全面验证。
