《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Improving the Activity of Aminophenoxazinones: Synthesis, CPC Purification, and Phytotoxicity Potential
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本研究采用氧化环缩合策略，对氨基苯并噁嗪酮(APO)核心结构进行系统性修饰，合成了卤代、羧酸及含氮杂环三类衍生物库，并利用离心分配色谱(CPC)成功克服了该类化合物在传统固相色谱上吸附强、回收率低的纯化难题。生物活性筛选发现，化合物10和11对杂草（P. oleracea, L. rigidum）根部生长抑制效果显著，其中10对P. oleracea根部的IC50仅为4.5 μM，远优于天然APO (332.5 μM)。构效关系(SAR)分析揭示了C-8位电负性原子（如F）与C-4位碘原子的协同增效作用，为开发低抗性、可持续的生物除草剂先导化合物提供了有力依据。
引言
氨基苯并噁嗪酮(APO)是禾本科（如玉米、小麦、黑麦）作物释放的苯并噁嗪酮类化合物的降解产物，是一种具有强植物毒性的代谢物和组蛋白去乙酰化酶(HDA)抑制剂。作为一种化感物质，APO通过抑制HDA干扰基因表达调控，从而减缓目标植物的生长发育。由于HDA在进化中高度保守，其靶点抗性(TSR)极难产生，这赋予了APO及其衍生物低抗性生物除草剂的潜力。然而，传统合成除草剂存在环境污染、土壤残留、破坏生态及引发广泛抗性等问题，促使研究者转向天然产物及其衍生物作为可持续的替代方案。本研究旨在通过理性设计，对APO核心骨架进行定向修饰，以优化其理化性质和生物活性，并克服其纯化难题，筛选出高效的候选除草剂先导化合物。
材料与方法
本研究合成了包含卤代、羧酸及含氮杂环(NHNPs)三类官能团的APO衍生物库。合成采用两种氧化环缩合策略：1) 使用叔丁基过氧化氢/氧化硒(TBHP/SeO2)体系；2) 使用碘酸钠(NaIO3)体系。合成路线涉及以不同的氨基酚为起始原料，通过特定的反应条件制备目标化合物，详细的反应物比例、条件及产物参见原文图表。
由于APO及其衍生物与常规色谱固定相（如硅胶）存在强相互作用，导致回收率低，本研究采用无固体固定相的离心分配色谱(CPC)进行纯化。CPC基于分析物在两相不互溶液体体系中的分配系数进行分离。研究测试了包括HEMWat（正己烷/乙酸乙酯/甲醇/水）在内的多种溶剂体系，并通过添加1,2-二甲氧基乙烷(DME)等添加剂优化溶解度和分离效果。纯化条件（溶剂体系、模式、流速、转速等）及结果（回收率、纯度）在文中表格有详细总结。
生物活性评价分为两个层次：首先，通过小麦胚芽鞘伸长生化实验进行初步、快速的植物毒性筛选。化合物溶解于DMSO后用缓冲液稀释至不同浓度（10-1000 μM），以商业除草剂Logran Extra 60作为阳性对照，评估其对小麦胚芽鞘伸长的抑制或刺激作用。其次，对初筛活性优异的化合物，进一步在三种重要杂草种子：Lolium rigidum（黑麦草）、Portulaca oleracea（马齿苋）和Plantago lanceolata（长叶车前）上进行植物毒性测试。测试在培养皿中进行，评估化合物在10-1000 μM浓度下对种子萌发、根长和芽长的影响，并以pendimethalin（Stomp Aqua活性成分）作为阳性对照。使用GraphPad Prism软件拟合剂量反应曲线计算IC50值，并使用ChemBioDraw软件计算理论分配系数(Clog P)。
结果与讨论
合成
研究成功合成了系列APO衍生物，但合成策略的选择对产物有决定性影响。使用NaIO3氧化剂能有效促进所有三类底物的环缩合，但会产生明显的碘化副反应，特别是在C-4位，例如氟化衍生物3的合成中，其碘化副产物10成为主要产物（产率84%）。而TBHP/SeO2体系可避免碘化，但反应区域选择性受底物控制：对于2-氨基-4-溴苯酚，遵循热力学机制生成C-4和C-8双溴代产物2；而对于2-氨基-4-氟苯酚，则仍遵循动力学途径生成目标产物。该体系不适用于酸性衍生物的合成，且用于合成含氮稠环衍生物时反应不干净，伴有自反应副产物。
纯化
CPC被证明是克服强吸附、实现高回收率纯化的关键。主要挑战在于目标化合物在标准两相溶剂体系（如HEMWat）中溶解度极低。通过优化溶剂体系，特别是添加DME，显著提高了样品溶解度（如反应5的溶解度从27%提升至71%），从而使纯化得以进行。对于酸性衍生物（反应7），即使在添加DME后溶解度仍很差（10%），且出现化合物异常“渗漏”现象，最终通过酸化溶剂系统（添加0.1%甲酸）成功实现了化合物7的高纯度（97%）洗脱。纯化方法成功从分析型FCPC放大到制备型mCPC/cCPC，放大后通常由于转速和转子体积增加，获得了更高的固定相保留率(Sf)和分辨率。多数纯化试验实现了接近100%的样品回收，最终化合物纯度达90-99%。
表征
通过核磁共振(NMR)和高分辨质谱(HRMS)对所有合成衍生物进行了结构确证。碘代衍生物在13C NMR中C-4位碳信号显著向高场位移（从~103 ppm移至~81 ppm），证实了碘的引入。氟代衍生物由于19F核的耦合，在1H和13C NMR谱中显示出特征裂分模式。含氮杂环衍生物在1H NMR中质子信号相对于母体APO发生普遍去屏蔽，且在13C NMR中C-1位（约98 ppm）的信号完全消失，证实了该位置被氮原子取代。羧酸衍生物则通过羧基碳的特征信号（~167 ppm）及相关质子信号的缺失得以确认。
生物活性
小麦胚芽鞘生物测定
大多数化合物在高浓度（1000 μM）下对小麦胚芽鞘伸长的抑制率超过65%。该初筛帮助排除了活性较APO弱的衍生物（5, 7, 8, 13, 15），并初步识别出在C-1或C-4位含碘（6, 9, 10）及在C-8位含氟（3, 10）的衍生物具有高抑制活性，部分可达100%抑制。
对杂草的植物毒性
在三种杂草的测试中，所有测试化合物均未显著抑制P. oleracea和L. rigidum的萌发，但能显著抑制其根部生长。化合物10（C-8位氟，C-4位碘）和11（含氮杂环）表现出最强的根部抑制活性。在P. oleracea上，10和11在1000 μM浓度下分别造成77%和89%的根长抑制，其中11的效果与阳性对照pendimethalin（86%）相当。尤为突出的是，10即使在最低测试浓度（10 μM）下，对P. oleracea根部仍保持61%的抑制率，其IC50值低至4.5 μM，远优于天然APO的332.5 μM。在L. rigidum上，10和11也分别达到70%和80%的根部抑制。对芽长的抑制效果较弱，仅在P. oleracea中观察到10和11的显著抑制。
对于P. lanceolata，卤代衍生物对其萌发、根和芽的生长均有显著抑制。含氮且C-7/C-8位卤代的衍生物12在1000 μM时对萌发抑制率达83%。在根和芽生长抑制方面，C-8位含高电负性取代基（氟或溴）的化合物3, 10, 4表现出约80%的抑制率。与另两种杂草不同，C-4位碘原子对P. lanceolata的抑制并非必需，但能延长10在稀释后的活性持续时间。
构效关系总结
基于全面的生物测定数据，研究总结出清晰的构效关系(SAR)：
- 1.
在C-8位引入电负性原子（如F, Br）可普遍增强植物毒性。
- 2.
在C-4位引入碘原子可独立增强化合物效能。
- 3.
在1位或9位用氮原子取代碳，可提高对P. lanceolata的活性。
- 4.
最重要的是，C-8位氟与C-4位碘的协同组合（如化合物10）能产生广谱且高效的植物毒性，成为最具潜力的先导结构。
结论
本研究通过理性的结构设计，成功合成并纯化了一个氨基苯并噁嗪酮衍生物库。离心分配色谱(CPC)的应用有效解决了该类化合物纯化回收率低的难题。植物毒性评价表明，衍生物10和11对多种杂草的根部生长具有显著抑制作用，其中化合物10（2-氨基-8-氟-4-碘-3H-吩噁嗪-3-酮）活性最为突出，其对马齿苋根部的IC50值较天然APO提高了近74倍。构效关系分析揭示了关键取代位点（C-8和C-4）对活性的决定性影响。该工作不仅验证了基于APO骨架进行理性设计以优化生物除草剂活性的策略，也为开发具有低抗性风险、环境相容性更好的可持续杂草治理方案提供了有价值的先导化合物。
