利用分子标记对甜菜单胚二系不育系（Beta vulgaris L.）的育性进行鉴定研究

《Horticulturae》：Study on Fertility Identification of Monogerm Binary Male-Sterile Lines in Sugar Beet (Beta vulgaris L.) Using Molecular Markers Ruxiao Song, Zedong Wu and Linlin Sun

本文推荐这篇关于甜菜（Beta vulgaris L.）杂交育种技术的研究。该工作利用TR1和s17分子标记，对来自国内三家科研机构的7份单胚二系不育系（297株个体）进行了胞质（S/N型）和核基因Rf1位点的育性基因型鉴定，首次系统评估了这些种质资源的育性纯度。研究揭示了部分品系存在保持系（N型胞质）和恢复基因（1300/1800 bp复合带型）污染的问题。其中，仅酶切验证为4/4基因型（1000 bp + 700 bp条带）的材料被确认为携带纯合隐性核不育基因（rf1/rf1）的候选材料。该方法可在苗期快速、准确鉴定甜菜单胚二系不育系，相比传统杂交鉴定法可缩短育种周期3年，为控制杂交制种母本纯度、提高育种效率提供了科学依据和技术支持，对保障我国北方糖料作物生产安全具有重要意义。

　　

利用分子标记对甜菜单胚二系雄性不育系进行育性鉴定的研究

1. 1.
   引言
   甜菜（Beta vulgaris L.）是全球第二大糖料作物，也是我国北方重要的糖料和潜在能源作物。利用杂种优势是突破其产量与品质瓶颈的关键，而二系雄性不育系的育性鉴定是确保杂交种子纯度的核心环节。甜菜为无限花序，人工去雄不可行，这显著增加了杂交制种的难度。单胚二系不育系是支撑杂交制种的母本，其本质上是通过特定授粉组合形成的稳定不育体系。传统鉴定方法依赖杂交与田间表型观察，需历时约3年，且耗费大量人力物力。为了快速、准确地鉴定甜菜单胚二系不育系的育性组成，保障甜菜杂交制种中母本系纯度并提高育种效率，本研究采用分子标记技术对来自我国三个科研机构的7份单胚二系不育系种质资源（共计297株个体）进行了育性鉴定。
2. 2.
   材料与方法
   实验材料为由吉林省农业科学院、石河子甜菜研究所和黑龙江大学甜菜改良团队提供的7份单胚二系不育系种质资源（297株个体）。基因组DNA采用CTAB法从甜菜幼嫩叶片中提取。利用TR1引物进行胞质育性类型鉴定，根据扩增条带大小判断：小于500 bp为不育S型胞质，大于500 bp为可育N型胞质。利用s17分子标记结合Hap II和Hind III双酶切，对核基因组Rf1位点的育性基因组成进行验证。s17引物的扩增产物主要有1800 bp、1300 bp及1800/1300 bp复合型三种。其中，仅获得1800 bp扩增条带的样品需进一步用Hap II和Hind III进行双酶切，根据酶切产物条带模式确定基因型：单一1800 bp条带（对应5/5等位基因组合）、三条带1800 bp + 1000 bp + 700 bp（对应4/5基因型）和两条带1000 bp + 700 bp（对应4/4基因型）。值得注意的是，本研究仅确认4/4型与已知的纯合隐性核不育基因型（rf1/rf1）一致，而5/5和4/5型是否与隐性核不育基因相关尚需通过后续田间试验验证。
3. 3.
   结果
   3.1. 胞质育性类型鉴定结果分析
   TR1引物鉴定结果显示，1号品系中93.33%为S型胞质，6.67%为大于500 bp的N型可育胞质。2至7号品系的扩增条带类型均为S型胞质，比例达到100%。这表明2至7号品系的胞质雄性不育（CMS）性状总体稳定。而1号品系中部分N型胞质的存在，表明该品系在繁殖过程中混杂了保持系。

3.2. 核基因组Rf1位点基因型鉴定分析

使用s17引物对297份材料进行PCR扩增，共277份测试材料呈现单一的1800 bp扩增条带。其中，1至3号品系均只显示1800 bp条带，表明其核育性基因型稳定。相比之下，4至7号品系中有少量材料（共20株）显示出1300/1800 bp复合条带类型，表明其育性相关基因存在遗传混杂，即存在恢复基因的渐渗。

3.3. 酶切验证结果鉴定分析

对随机选取的7个品系各5株（共35株）的s17 PCR扩增的1800 bp产物进行Hap II和Hind III双酶切验证，共获得三种基因型：5/5基因型6株，占17.1%；4/5基因型3株，占8.6%；4/4基因型26株，占74.3%。本研究中，仅将呈现1000 bp + 700 bp两条带的4/4基因型鉴定为携带纯合隐性核不育相关基因（rf1/rf1）的候选材料；5/5和4/5基因型初步视为潜在的隐性核不育基因型，其与核不育基因的对应关系尚不明确，需进一步验证。

1. 4.
   讨论
   本研究利用TR1和s17分子标记，系统鉴定了三家国内科研机构提供的7份甜菜单胚二系CMS（胞质雄性不育）系的胞质类型及核Rf1位点的育性基因型。胞质鉴定结果显示，2至7号品系S型胞质比例达100%，不育性稳定，说明在繁殖过程中没有保持系混入。1号品系中检测到6.67%的N型胞质，推测是在其选育过程中，母本CMS系不慎混入了保持系，这主要是由于制种或收获过程中的机械混杂所致。同样，在核基因组Rf1位点鉴定中，4至7号品系中6.73%（20株）的材料检测到1800/1300 bp复合条带模式，表明有恢复基因渐渗。这种污染现象可能源于两方面：其一，在单胚二系CMS系选育过程中，由于甜菜是异花授粉作物，花粉传播距离可达1000-2000米，若种植时CMS系与恢复系隔离距离不足，可能导致外来恢复系花粉授粉，造成核基因污染；其二，保持系本身的核育性基因背景中，可能存在个别植株残留恢复基因，尽管概率较低。
   在等位基因层面，本研究利用s17标记获得的1800 bp扩增条带基本可鉴定为携带纯合隐性核不育相关基因。进一步的酶切验证表明，只有4/4基因型被确认为携带纯合隐性核不育相关基因的候选材料；目前尚不清楚5/5和4/5基因型是否代表纯合隐性不育基因，有待进一步验证。值得注意的是，与传统杂交鉴定方法相比，本研究采用的分子标记体系可在苗期完成育性鉴定，将育种周期缩短3年，显著提高育种效率。然而，本研究也存在一定局限性：由于酶切验证样本量有限，仅从每个品系随机选取5株（共35株）进行验证，所得基因型频率仅反映验证样本的分布，尚未外推至所有277株材料。未来研究应扩大样本量，并结合田间表型调查，以进一步验证该标记体系的普适性。
   从跨作物角度看，雄性不育不仅是甜菜育种的核心瓶颈，也是大豆等其他高价值作物遗传改良的共同制约。本研究建立的TR1 + s17分子标记鉴定体系，不仅适用于甜菜CMS系的纯度控制，也可为大豆等相关作物CMS系选育及亲本提纯提供技术借鉴。
2. 5.
   结论
   本研究利用TR1和s17分子标记，系统鉴定了国内三家科研机构提供的7份甜菜单胚二系CMS系297株个体的胞质和核育性基因型。胞质鉴定结果表明，2至7号品系S型胞质比例达100%，不育性稳定；1号品系检测到6.67%的N型胞质，表明该品系在选育过程中混入了保持系，主要源于制种或收获时的机械混杂。在核Rf1位点鉴定中，93.27%（277株）的材料扩增出1800 bp目标条带；其中1至3号品系均呈现单一的1800 bp条带模式，核育性基因型纯合一致。4至7号品系中6.73%（20株）检测到1800/1300 bp复合条带模式，表明存在恢复基因等位基因的渐渗，可能与外来恢复系花粉污染或保持系亲本中残留的恢复基因有关。基于35份样品的双酶切验证表明，仅4/4基因型（1000 bp + 700 bp双条带）可被确认为携带纯合隐性核不育相关基因（rf1/rf1）的候选材料，而5/5和4/5基因型与隐性核不育基因的对应关系尚不明确，需通过后续田间试验进一步验证。
   本研究证实，TR1 + s17分子标记体系可在苗期快速、准确地鉴定甜菜单胚二系CMS系的育性基因型。与传统杂交鉴定方法相比，可将育种周期缩短3年，显著提高育种效率。为确保三系杂交种的纯度，建议在亲本繁殖过程中进一步加强隔离措施，并整合分子标记辅助提纯，从源头消除保持系混杂和恢复基因渐渗的风险。未来研究应扩大样本量，并结合田间表型调查，以进一步验证该标记体系的普适性，从而提高鉴定准确性。