《Horticulturae》：Defense Mechanisms Induced by DYDS and Dufulin Against Alfalfa Mosaic Virus (AMV) Infection in Cowpea
Xin Zhou,
Qiaolan Liang,
Liexin Wei,
Ying’e Chen and
Shiyu Lai
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本文综述了两种植物免疫诱导剂DYDS（拟青霉提取物）和Dufulin对苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus, AMV）的防控机制。研究通过体外抑制、保护与治疗活性实验证实，二者能显著降低AMV外壳蛋白（CP）表达，减轻叶绿素损失，并增强超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）和L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）等防御酶活性。分子对接显示DYDS和Dufulin能与AMV-CP自发结合，基因表达分析表明二者通过整合激活水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号通路触发免疫反应。这为豆科作物病毒病的可持续治理提供了“直接抑制病毒+宿主免疫启动”的双重作用新策略。
2. 材料与方法
2.1 病毒与药剂材料
苜蓿花叶病毒（AMV）采用Tian法纯化，浓度300.00 pg/mL，保存于-80 °C。DYDS为拟青霉（Paecilomyces variotii）乙醇粗提物，化学式C10H13N5O4。Dufulin（DFL）化学式C19H22FN2O3PS。香菇多糖（Lentinan, LNT）化学式C42H72O36。
2.2 供试植物与培养条件
供试植物为豇豆（Vigna unguiculata）和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）。种子在25 °C暗培养发芽后播种于灭菌土，人工气候室培养（25 °C，60-70%相对湿度，16 h光照/8 h黑暗，光强10,000 lux）。
2.3 体外抗病毒活性测定
采用半叶枯斑法评估DYDS和Dufulin对AMV的抑制效果。设置AMV接种对照、化学对照（2500 μg·mL?1LNT）、DYDS处理（40 μg·mL?1）和Dufulin处理（2000 μg·mL?1）。药剂与AMV等体积混合孵育5-30 min后摩擦接种，3 dpi计数枯斑，7 dpi通过RT-qPCR定量AMV-CP基因表达计算抑制率。
2.4 保护与治疗活性评价
参考Chen等方法。DYDS（20 μg·mL?1）、Dufulin（1000 μg·mL?1）和LNT（1250 μg·mL?1）用无菌水配制。保护活性：先叶面喷施药剂，24 h后接种AMV；治疗活性：先接种AMV，24 h后喷施药剂。3 dpi计数枯斑，7 dpi通过RT-qPCR分析AMV-CP基因表达。
2.5 DYDS和Dufulin对AMV-CP-GFP在本氏烟草中表达的影响
2.5.1 AMV-CP-GFP在本氏烟草中的瞬时表达
将二元载体pCAMBIA2300-GFP-AMV-CP转入根癌农杆菌GV3101，培养后调整OD600=0.5，暗培养3 h，注射渗透至本氏烟草下表皮。
2.5.2 DYDS和Dufulin对AMV-CP表达的影响
参照Wuzilin等方法。选取4-5叶期本氏烟草，分为DYDS（20 μg·mL?1）、Dufulin（1000 μg·mL?1）、LNT（1250 μg·mL?1）和清水对照四组，先叶面喷施，24 h后注射农杆菌菌液。3 dpi通过共聚焦显微镜观察GFP荧光。
2.6 分子对接
从PubChem数据库获取DYDS、Dufulin和LNT分子结构，用AutoDock 4 Tools加氢、分配电荷。AMV-CP氨基酸序列提交至SWISS-MODEL进行同源建模（模板PDB ID: 7epp，序列一致性95.93%），预测三级结构。用AutoDock Vina进行分子对接，预测结合模式，选择最有利构象（最低结合能）在PyMOL中可视化分析相互作用残基和分子力。
2.7 DYDS和Dufulin对AMV侵染豇豆生理生化参数的影响
基于2.4节结果，选取均匀两叶期豇豆进行保护或治疗处理。设置5个处理：接种对照（AMV）、健康对照（CK）、药剂对照（LNT + AMV）、DFL + AMV（1000 μg·mL?1）和DYDS + AMV（20 μg·mL?1）。每处理3个生物学重复，接种后在人工气候室培养。于接种后1、3、5、7、9 dpi取样。
2.8 叶绿素含量测定
参照Chen Ying’e方法。取0.5 g鲜叶样品，用含0.1 g CaCO3的95%乙醇研磨，暗处提取24 h，5000× g离心5 min，测定665 nm、649 nm和470 nm处吸光度，计算叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、总叶绿素（T-Chl）和类胡萝卜素（Car）含量。
2.9 防御酶活性测定
2.9.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性
参考WANG法。反应体系含0.05 mol/L PBS（pH 7.8）、130 mmol/L Met、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA-Na2、20 μmol/L核黄素和粗酶液，光照20 min后测定560 nm吸光度，以抑制NBT光化学还原50%为一个酶活力单位。
2.9.2 过氧化物酶（POD）活性
参考Rathmell & Sequeira法。反应体系含0.05 mol/L PBS（pH 5.5）、2% H2O2、0.05 mol/L愈创木酚和粗酶液，37 °C水浴5 min，测定470 nm吸光度变化，以每分钟OD470变化0.01为一个酶活力单位U/(g·min)。
2.9.3 过氧化氢酶（CAT）活性
参考Lu Shaoyun法。反应体系含0.05 mol/L PBS（pH 7.8）、0.08% H2O2和粗酶液，测定240 nm吸光度，3 min后读数，以每分钟OD240变化0.01为一个酶活力单位U/(g·min)。
2.9.4 多酚氧化酶（PPO）活性
采用邻苯二酚法测定。反应体系含0.05 mol/L PBS（pH 6.8）、0.1 mol/L邻苯二酚和粗酶液，测定398 nm吸光度，以每分钟OD398变化0.01为一个酶活力单位。
2.9.5 L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性
参考Zucker法。反应体系含0.1 mol/L硼酸缓冲液（pH 8.8）、0.02 mol/L L-苯丙氨酸和粗酶液，40 °C水浴1 h，加0.2 mL 6 mol/L HCl终止反应，测定290 nm吸光度，以每小时OD290变化0.01为一个酶活力单位。
3. 结果
3.1 DYDS和Dufulin对AMV的体外抑制活性
DYDS和Dufulin对AMV均表现出显著体外抑制活性，抑制率均超过21.00%，其中DYDS整体表现更优。RT-qPCR和免疫荧光检测证实，处理植株中AMV-CP表达显著下调。
3.2 DYDS和Dufulin的保护与治疗活性
保护活性和治疗活性测定显示，DYDS和Dufulin处理均能显著减少枯斑数量，降低AMV-CP基因表达，两种活性均超过21.00%。
3.3 DYDS和Dufulin对AMV-CP-GFP表达的影响
共聚焦显微镜观察显示，DYDS和Dufulin预处理能显著减弱AMV-CP-GFP在本氏烟草叶片中的荧光信号，表明二者能抑制AMV-CP在植物体内的积累。
3.4 分子对接结果
分子对接模拟显示，DYDS和Dufulin能与AMV-CP自发结合，结合自由能分别为-6.5 kcal/mol和-5.8 kcal/mol。结合模式分析表明，二者通过氢键和疏水相互作用与AMV-CP关键残基结合，可能直接干扰病毒组装或移动。
3.5 DYDS和Dufulin对叶绿素含量的影响
外源施用DYDS和Dufulin能缓解AMV侵染引起的叶绿素损失。在接种后5 dpi，处理植株的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著高于病毒对照。
3.6 DYDS和Dufulin对防御酶活性的影响
DYDS和Dufulin处理能显著增强AMV侵染豇豆叶片中SOD、POD、CAT、PPO和PAL的活性。这些防御酶活性在接种后5 dpi达到峰值，表明免疫诱导剂能快速激活植物抗氧化系统和苯丙烷代谢途径。
3.7 基因表达分析
基因表达分析表明，DYDS和Dufulin能通过整合激活水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）信号通路，触发强烈的免疫反应。SA通路标志基因PR1、JA通路标志基因LOX和ET通路标志基因ERF1的表达均显著上调。
4. 讨论
本研究系统阐明了DYDS和Dufulin对AMV的双重作用机制：一是直接与病毒外壳蛋白（CP）结合，抑制病毒复制和移动；二是通过激活SA、JA和ET信号通路，启动植物系统获得性抗性（SAR），增强防御酶活性和抗氧化能力。这两种免疫诱导剂不仅能有效控制AMV对豇豆的侵染，还能缓解病毒引起的生理损伤，如叶绿素降解。分子对接结果从结构层面揭示了其直接抗病毒活性的分子基础。该研究为利用植物免疫诱导剂防控豆科作物病毒病提供了重要的理论依据和实践策略，展示了一种环境友好、可持续的病毒病治理新途径。
