《Horticulturae》：Improving Soil Health in Bamboo Forests Through the Cultivation of Stropharia rugosoannulata on Bamboo Residues
Xin Wang,
Dongchen Li,
Xiaocao Liu,
Baoxi Wang,
Xianhao Cheng,
Wei Zhang and
Jinzhong Xie
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本文综述了一项旨在探究利用农业废弃物（竹屑）栽培食药用真菌大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）对竹林土壤生态系统影响的创新性研究。通过田间实验，结合土壤化学、酶学、微生物组学（16S rRNA/ITS测序）及代谢组学（UPLC-MS/MS）等多组学技术，系统揭示了“竹屑输入-菌丝激活-微生物群落重组-酶活调节-代谢网络协同”这一耦合循环如何驱动土壤有机碳（SOC）、全氮（TN）及速效氮（AHN）等养分的显著提升。研究不仅为竹业废弃物的高值化、生态化利用提供了科学依据，也为构建可持续的“菌-林”协同培育模式提供了可验证的生态模型。
引言
大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）被联合国粮农组织推荐为林下经济菇种，因其色泽鲜艳、营养价值高（富含蛋白质和生物活性多糖）且抗逆性强。在竹林系统中栽培该菌，对激活生态资源、推动可持续发展具有显著潜力。该菌能分泌纤维素酶、半纤维素酶和木质素降解酶等胞外酶，促进栽培基质的分解，从而改善土壤通气性、保持土壤结构、平衡养分有效性、提高土壤酶活性并促进微生物多样性。然而，尽管已有研究证实利用竹屑作为替代栽培基质的可行性，但使用竹基质栽培大球盖菇对竹林生态系统土壤理化性质、酶活性、微生物群落结构及代谢物谱的综合效应仍不清楚。以往研究未能系统阐明竹屑分解、微生物动态与土壤反馈之间的相互关系，尤其缺乏对土壤有机质转化、微生物介导的化感相互作用及竹林土壤生态平衡维持机制的深入探究。本研究聚焦于“竹屑-大球盖菇栽培-土壤健康”之间的关系，旨在填补这一知识空白。
材料与方法
2.1. 研究地点与采样方法
试验在中国林业科学研究院亚热带林业研究所（浙江省杭州市富阳区）进行。该地区属亚热带季风气候。试验前，将过筛的洁净竹屑与4%菜籽饼均匀混合并发酵，作为栽培基质。沿等高线开挖种植沟，采用分层铺料的方式接种菌种。种植于当年10月下旬完成，次年4月下旬完成采收。土壤采样分两次进行：首次在10月中旬处理前（即接种大球盖菇前），作为基线对照；第二次在次年10月中旬，即大球盖菇完成一个完整生长周期后，作为处理组。采用随机区组设计，每个处理设置三个独立的生物学重复。
2.2. 土壤非生物因子测定
测定了土壤pH、有机碳（SOC）、全氮（TN）、碱解氮（AHN）、全磷（TP）、速效磷、全钾（TK）、速效钾，以及蔗糖酶（SSC）、脲酶（UE）、过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PO）、中性蛋白酶（NPT）和酸性磷酸酶（ACP）的活性。
2.3. DNA提取、PCR扩增与测序
对处理和对照组土壤样本进行16S rRNA和ITS2测序。使用特异性引物对分别扩增细菌16S rDNA的V3-V4高变区和真菌的ITS2区。PCR产物纯化后，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序。原始序列经质控、拼接后，在97%相似度水平下聚类为操作分类单元。
2.4. 非靶向代谢组学：样品制备与分析
土壤样品经液氮研磨后，用预冷的提取液（80%甲醇，0.1%甲酸）提取代谢物。使用超高效液相色谱串联高分辨质谱系统进行分析。原始数据经转换、峰提取、对齐和积分后，通过匹配内部MS2谱图数据库进行代谢物注释。采用主成分分析、偏最小二乘判别分析和正交偏最小二乘判别分析进行多变量统计分析。差异累积代谢物需同时满足变量重要性投影值≥1和t检验p值<0.05。
2.5. 统计分析
采用配对t检验评估栽培前后土壤性质的差异显著性。在QIIME中使用香农、Chao1和ACE指数估算α多样性。使用R语言psych包计算环境因子与微生物类群间的皮尔逊相关系数。
结果
3.1. 序列数据、微生物丰富度与多样性
质控后，细菌和真菌的有效标签数范围分别为46,204-53,820和33,529-58,133。在97%相似度下，分别聚类得到7428个细菌OTU和1511个真菌OTU。与大球盖菇栽培前相比，栽培后土壤细菌的香农指数显著增加。对于真菌，栽培后土壤的Chao1和ACE指数较对照显著增加。这表明大球盖菇栽培改变了土壤微生物群落的多样性和丰富度指数。
3.2. 基于16S rRNA和ITS测序的微生物群落组成
主成分分析显示，栽培大球盖菇前后，细菌和真菌群落结构存在明显区分，且栽培对真菌群落的影响比细菌更显著。在门水平上，栽培显著改变了与活性养分循环相关的类群丰度。例如，变形菌门、疣微菌门和浮霉菌门的相对丰度增加，而适应寡营养条件的酸杆菌门和绿弯菌门的相对丰度显著降低。在属水平上，与植物促生和有机物降解相关的伯克霍尔德菌属-肠杆菌属复合体等丰度增加，而与寡营养环境相关的类群丰度下降。对于真菌，与有机物分解、植物共生和养分获取相关的子囊菌门、被孢霉门和球囊菌门丰度增加，而担子菌门和毛霉门丰度下降。在属水平上，具有生防和土壤养分活化潜力的木霉属和被孢霉属丰度显著增加。
3.3. 大球盖菇栽培对土壤理化性质的影响
大球盖菇栽培有效促进了土壤碳氮养分的转化与释放。土壤有机碳、碱解氮和全氮含量分别显著增加了34.6%、30.6%和36.9%，而土壤pH显著降低了2.2%。参与易分解碳转化的蔗糖酶活性，以及参与氮循环的脲酶和中性蛋白酶活性均显著增强。参与木质素等难分解碳分解的过氧化物酶活性也显著提高。但多酚氧化酶和酸性磷酸酶活性未检测到显著变化。
3.4. 栽培大球盖菇后土壤代谢物的变化
代谢组学分析显示，处理组与对照组土壤代谢物谱明显分离。共鉴定出145个差异累积代谢物，其中92个上调，53个下调。差异代谢物主要富集在与土壤养分循环和微生物代谢相关的关键通路中，包括嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、植物次级代谢物生物合成、淀粉和蔗糖代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢。
3.5. 土壤理化性质与代谢物对微生物群落的影响
相关性分析揭示了微生物类群与土壤性质及酶活性之间的复杂网络。在细菌属水平，伯克霍尔德菌属-卡巴莱罗尼亚属-副伯克霍尔德菌复合体和酸杆菌属与土壤有机碳和碱解氮呈显著正相关。在细菌门水平，变形菌门与过氧化物酶活性正相关，厚壁菌门与蔗糖酶和中性蛋白酶活性负相关，浮霉菌门与蔗糖酶和脲酶活性正相关。对于真菌，许多属与土壤酶活性呈显著负相关，但镰刀菌属与过氧化物酶和多酚氧化酶活性正相关。伞状霉属与蔗糖酶、脲酶和过氧化物酶活性正相关，但与全氮和pH负相关。
微生物与土壤代谢物也存在显著关联。厚壁菌门与最广泛的代谢物呈显著正相关，包括真菌毒素、激素、脂质等。相反，浮霉菌门和帕特西菌门与一些相同的代谢物呈负相关，暗示了类群间潜在的竞争或拮抗作用。在真菌门水平，镰刀菌毒素B1与担子菌门正相关，与子囊菌门负相关。
讨论
4.1. 利用竹屑栽培大球盖菇对竹林土壤理化性质及酶活性的影响
土壤有机碳的增加可能与菌丝分解竹屑中的纤维素、木质素和半纤维素，并将其转化为进入土壤的代谢产物有关。碱解氮和全氮的增加可归因于栽培基质（特别是添加了4%菜籽饼的发酵竹屑）的分解、菌丝分泌的胞外酶加速有机质矿化、以及菌丝生物量及其残体的积累。土壤pH的下降可能源于栽培基质微生物代谢分解产生的酸性中间产物，以及氮转化过程释放的H+。蔗糖酶、中性蛋白酶、脲酶和过氧化物酶活性的增强分别与菌丝对碳源、蛋白质、氮源的需求以及清除活性氧以维持生理稳定有关。
4.2. 对微生物群落多样性、丰富度及组成的影响
栽培后土壤细菌α多样性增加，群落组成发生变化。酸杆菌门等偏好低碳环境的类群丰度下降，而变形菌门等纤维素降解菌丰度上升。厚壁菌门丰度下降可能与竹屑复杂碳结构导致的易利用碳源减少及与菌丝竞争加剧有关。疣微菌门丰度增加可能与竹屑发酵后期产生的有机酸为其提供了合适碳源有关。真菌群落也发生显著变化，子囊菌门、被孢霉门、球囊菌门丰度增加，担子菌门、毛霉门丰度下降。这些变化是基质发酵引起的理化性质改变与菌丝-微生物相互作用共同驱动的结果。
4.3. 对代谢物及代谢通路的影响
代谢组学分析表明，栽培大球盖菇显著改变了土壤代谢物谱。富集的氨基酸、肽类和碳水化合物为微生物提供了易利用的氮源和碳源。脂质代谢通路（如甘油磷脂代谢）的全面激活增强了土著微生物的环境适应性。嘌呤代谢的高度富集提示大球盖菇可能将竹屑中难分解的木质素结合氮转化为与竹林氮吸收模式更同步的缓释氮库。此外，类黄酮、萜类等生物活性次级代谢物及其合成通路的富集，可能在低浓度下作为信号分子调节竹林生长并增强其诱导抗性。
4.4. 土壤差异代谢物与微生物的关联分析
厚壁菌门与多种代谢物（包括真菌毒素、激素、脂质等）呈广泛正相关，可能成为代谢物积累的生物指示器。相反，浮霉菌门和帕特西菌门与一些相同代谢物呈负相关，可能扮演“清道夫”或“调节者”角色。这些相关性揭示了竹屑栽培体系中土壤微生态相互作用的复杂性，为评估和管理真菌毒素风险、优化栽培以提升产品安全性和土壤质量提供了重要线索。
4.5. 土壤理化性质、土壤酶与微生物的关联分析
相关性分析揭示了一个相互作用网络。具有有机物分解、固氮、解磷等生态功能的细菌属与土壤有机碳和碱解氮正相关。变形菌门与过氧化物酶活性正相关，与其参与木质素等复杂有机物降解的能力一致。浮霉菌门与蔗糖酶和脲酶活性正相关，可能与其高效的复杂有机碳分解及厌氧氨氧化过程有关。真菌中，伞状霉属通过分解木质纤维素和几丁质来提升土壤有机碳和碱解氮。镰刀菌属则表现出双重功能，既是高效的木质素降解者，又可能因其潜在致病性而需谨慎对待。多种稀有真菌属通过功能分化和复杂的代谢协调，共同建立了一个高效的微生物降解网络，驱动竹屑来源的碳、氮、磷等养分的协同转化与高效循环。
4.6. 微生物-酶-代谢物-养分的耦合循环机制
基于上述发现，本研究推断并初步提出了一个由菌丝介导的“微生物-酶-代谢物-养分”耦合通路概念模型。大球盖菇菌丝作为主要驱动者，通过分泌木质素酶、纤维素酶等启动竹木质纤维素的分解，直接扩大了土壤有机碳库，并通过释放易降解碳底物和代谢物重塑土壤微生物群落。群落重组进一步调控了土壤酶活性谱。酶活的改变精确调控了养分循环途径，将大分子有机物转化为生物可利用的养分，显著提高了碱解氮和全氮含量。与此同时，代谢组学证据揭示了支持这一过程的功能性代谢网络。该模型为通过食用菌栽培实现农林废弃物循环利用、改善土壤健康、支持可持续森林管理提供了一个可检验的生态模型。
结论
本研究表明，竹屑的输入通过真菌菌丝分泌木质素酶和纤维素酶启动分解，并与土壤有机碳的增加相关联。所释放的易降解碳源和代谢物似乎重塑了微生物群落结构，富集了具有分解能力的关键功能类群。微生物群落的演替进一步对应于土壤酶活性谱的变化，共同促进了复杂有机物向植物可用养分的转化。代谢组学证据也表明，嘌呤代谢等通路的富集可能促进了顽固性氮向缓释氮库的转化。基于这些发现，我们提出了一个涵盖竹屑输入、菌丝激活、微生物群落重组、酶活调节和代谢网络协调的土壤健康改善概念模型。该研究为竹屑的高值化和生态化利用提供了初步的科学依据和技术视角。未来研究应关注该耦合机制的长期稳定性及其在不同竹林生态系统中的普适性。
