《Genes》：Condition-Specific Transcriptional and Metabolic Divergence in the Dual-Fungal Symbiosis of JinEr Mushroom Under Postharvest Low-Temperature Stress
Yuntao Li,
Hao Tang,
Fuwei Wang,
Chaotian Lv,
Bin Zhang and
Huan Li
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本研究通过整合代谢组学、转录组学（双基因组比对）与空间分辨酶活分析，系统揭示了金耳蘑菇（由Naematelia aurantialba与Stereum hirsutum共生形成）在0°C和4°C贮藏条件下的物种特异响应模式。研究发现，N. aurantialba倾向于强化应激防御（DNA修复、抗氧化途径），S. hirsutum则维持基础代谢稳态；共生体系表现出温度依赖的可塑性响应，0°C更利于保留粗多糖。该工作为异质共生真菌的采后生物学提供了新见解，并为贮藏优化奠定了温度靶向的理论基础。
1. 引言
金耳蘑菇（Golden Ear）是一种具有高经济与功能价值的食用菌，其独特之处在于其子实体并非由单一真菌形成，而是由Naematelia aurantialba（N. aurantialba）与Stereum hirsutum（S. hirsutum）通过异质共生构成的复合体。该共生关系对于形成具有商品价值的子实体至关重要：纯培养的N. aurantialba无法形成子实体，而S. hirsutum单独培养则产生形态迥异、无商品价值的结构。先前研究揭示了子实体内的空间分布格局：顶端区域（apical）两种真菌比例较为均衡，而基部区域（basal）及基质中S. hirsutum占绝对主导。这种空间分离提示两种共生菌可能存在功能分化，但其在环境胁迫（尤其是采后低温胁迫）下的分子基础尚不清楚。
低温贮藏是延缓食用菌衰老、保持其营养与感官品质最广泛应用且有效的方法之一。然而，关于金耳蘑菇这种异质共生体系在采后低温胁迫下的分子响应机制，特别是两种真菌伙伴如何协调其应答，目前仍知之甚少。因此，本研究采用整合系统生物学方法，结合非靶向代谢组学和转录组学，旨在探究金耳蘑菇子实体在两种低温条件（0°C和4°C）贮藏期间的动态生理变化，并重点解析N. aurantialba和S. hirsutum各自的转录与代谢调控，以提出一个情境特异的响应模型。
2. 材料与方法
研究使用来自单一栽培批次的新鲜金耳蘑菇子实体，将其分为五组：OS（第0天对照，未冷藏）、LS1/LS2（0°C贮藏4/8天）、HS1/HS2（4°C贮藏4/8天）。每组设3个生物学重复。
非靶向代谢组学分析采用UHPLC-MS/MS系统，使用XCMS进行数据处理，通过匹配HMDB、LIPIDMAPS和KEGG数据库鉴定代谢物。差异累积代谢物（DAMs）的筛选标准为：OPLS-DA模型的VIP>1，校正后p值（padj）<0.05，且倍数变化>1.5或<0.67。
转录组学分析采用Illumina HiSeq 4000平台进行测序。为准确量化双真菌共生复合体中的物种特异性转录本，研究采用了基于Salmon（v1.10.0）的物种特异性诱饵感知定量策略。分别以N. aurantialba和S. hirsutum的基因组注释为参考，构建组合索引进行转录本定量。差异表达基因（DEGs）的筛选标准为：|log2FC| ≥1.0且FDR<0.05。
此外，测定了超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽还原酶（GR）、8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶1（OGG1）、柠檬酸合酶（CS）和磷酸果糖激酶（PFK）五种关键酶的活性，并按照国家标准测定了子实体粗多糖含量。
3. 结果
3.1. 低温贮藏期间粗多糖含量的变化
贮藏温度和持续时间显著影响金耳蘑菇的粗多糖含量。在0°C和4°C条件下，粗多糖含量均随贮藏时间延长而显著下降，且在同一贮藏阶段，0°C下的含量始终高于4°C。4°C组的总降幅（约41.2%）比0°C组（约36.0%）更为显著，表明4°C下粗多糖降解更严重。
3.2. 全局代谢组变化揭示温度依赖性代谢变异
非靶向代谢组学分析共鉴定出2852种代谢物，其中脂质和类脂分子最为丰富。主成分分析（PCA）显示，样品的分离主要由贮藏时间驱动，温度次之。代谢调整在不同低温下呈现不同倾向：在0°C时，代谢响应以生存必需功能相关通路为主，如不饱和脂肪酸生物合成被激活（DAS=1），而甘油酯代谢等非核心通路被抑制；在4°C时，代谢模式更倾向于维持代谢稳态，基础代谢通路（如氨基糖和核苷酸糖代谢）持续激活，次级代谢相关通路（如泛醌和其他萜醌生物合成）也显著富集。
3.3. 低温响应的转录组学分析
转录组PCA显示，温度是样品分离的主要驱动力，这一模式在以S. hirsutum基因组为参考时更为明显。以N. aurantialba基因组为参考鉴定了更多的DEGs，其中LST2 vs. OST比较组差异最大（2743个DEGs）。
3.3.1. N. aurantialba：胁迫防御相关通路占主导
N. aurantialba的转录响应以遗传信息维护通路为主，涉及DNA修复和遗传信息稳态维持，如同源重组、错配修复和DNA复制通路显著富集。相比之下，代谢相关通路仅显示条件特异性的转录调控模式，缺乏核心响应特征。
3.3.2. S. hirsutum：基础代谢通路占主导
S. hirsutum对低温的转录响应主要由基础代谢维持和蛋白质稳态驱动，显著富集于碳水化合物和氨基酸代谢等核心代谢分支以及蛋白质代谢相关通路，未显著富集典型的胁迫防御通路（如DNA修复）。
3.3.3. N. aurantialba和S. hirsutum关键通路的基因表达与代谢变化整合分析
在基于S. hirsutum注释的TCA循环中，异柠檬酸、α-酮戊二酸和苹果酸相较于OST对照上调，而琥珀酸下调。然而，关键TCA循环基因（如Aco、Idh、Sdh）的表达却低于OST对照。在基于N. aurantialba注释的谷胱甘肽通路中，半胱氨酸和L-谷氨酸上调，而半胱氨酰甘氨酸下调。谷胱甘肽合成酶基因（Gss）在LST2组中上调，但在其他样本组中下调。
关键基因表达热图显示，N. aurantialba的胁迫防御相关基因（Gst、Mlh1、Ogg1）响应趋势各异，其中Ogg1在所有低温胁迫组中表达显著升高。S. hirsutum的基础代谢相关基因（Cs、Mdh、Cysk）在OST对照组中表达最高，在低温贮藏下均下调。
3.4. 转录组-代谢组整合相关分析
基于N. aurantialba转录组的分析显示，碱基切除修复基因Apn1与L-抗坏血酸呈正相关，且在0°C条件下相关性增强。谷胱甘肽代谢基因Gsr与NADPH在0°C条件下呈强负相关。基于S. hirsutum转录组的分析显示，TCA循环基因Cs与α-酮戊二酸在两种温度下均保持稳定的正相关。半胱氨酸合成基因Cysk与L-同型半胱氨酸在4°C下呈强负相关，但在0°C下无显著相关。
3.5. 酶活验证
酶活测定揭示了子实体内部显著的空间梯度。SOD和GR活性呈现“顶端（T）>中部（M）>基部（B）”的模式，这与N. aurantialba在顶端和中部的富集区域一致。CS和PFK活性则呈现相反的“B > M > T”梯度，与S. hirsutum在基部的优势分布相符。OGG1含量也显示出空间和处理相关的变异。
4. 讨论
本研究揭示，在研究的采后低温胁迫条件下，构成金耳蘑菇子实体的两种共生真菌表现出不同的应激响应模式。N. aurantialba在转录和酶活水平上表现出明显的胁迫防御倾向，其DEGs显著富集于DNA损伤修复和谷胱甘肽代谢等通路，且顶端区域的SOD和GR酶活性显著更高。这与先前报道的该真菌在子实体顶端比例相对较高的空间分布一致，其生态位更倾向于从共生伙伴获取营养以完成形态构建，而在采后冷藏中则表现出强化细胞和结构完整性的防御倾向。
相反，S. hirsutum的转录响应以基础代谢通路为主，其优势分布的基部区域显示出较高的CS和PFK等代谢酶活性。这与其在共生系统中作为基质分解和营养获取主要贡献者的“基石”角色相符。研究表明，在响应采后低温胁迫时，S. hirsutum表现出持续的基础代谢稳态倾向，可能有助于维持共生系统的整体稳定性。
研究还观察到，在两种真菌中，部分核心基因的下调与通路主要生物功能的保存并存。例如，尽管S. hirsutum的几个核心TCA循环基因在转录水平下调，但关键代谢物（如异柠檬酸、α-酮戊二酸）上调，且基部区域的代谢酶活性保持高位。这可能源于转录后调控、补偿性酶活、代谢通量重分配或通路冗余。
此外，金耳共生复合体的响应表现出明显的温度依赖性。在0°C时，系统转向基本的生存模式，以上调不饱和脂肪酸生物合成和抑制能量代谢为特征，旨在确保细胞基本结构完整。在4°C时，系统则转向更主动的维护与防御模式，其特征是同源重组修复通路和特定防御代谢物生物合成的激活。这反映了共生复合体对不同强度采后低温胁迫的分级响应特性。
需要指出的是，本研究观察到的差异响应基于多组学相关性数据和空间酶活测定，呈现的是一种情境特异的响应工作模型，而非固定的功能分工，仍需通过靶向实验（如单培养胁迫测试或遗传干扰研究）进行验证。
5. 结论
本研究揭示了在采后冷藏条件下，共生真菌N. aurantialba和S. hirsutum存在温度依赖的差异响应倾向。在研究条件下，N. aurantialba表现出增强的胁迫防御响应（如DNA修复、抗氧化系统），而S. hirsutum则表现出持续的基础代谢稳态。这种差异响应模式与0°C下多糖损失较慢、4°C下多糖损失更明显相关联。从实践角度，建议长期保存采用0°C，短期贮藏可采用4°C。这些发现增进了我们对异质共生真菌采后生物学的理解，并为贮藏优化提供了温度靶向的理论依据。
