《Antibodies》：Two Highly Specific Mouse Monoclonal Antibodies to the Putative C-Telopeptide of Human Collagen XIα1, a Cancer Biomarker
Marcos García-Oca?a,
Lorea Legazpi-Olabide,
Sandra Rodríguez-Rodero,
Paula Rodríguez-Folgueira,
Iván Fernández-Vega,
Marcos Ladreda-Mochales,
Juan R. de los Toyos and
Luis J. García-Flórez
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本研究首次成功制备了两种高度特异性的小鼠单克隆抗体（克隆3和克隆9），它们靶向人类胶原蛋白XIα1（COL11A1）的假定C端端肽（C-telopeptide）中的特定氨基酸序列RRHTEGMQA。该研究不仅深入表征了抗体的基因序列、表位特异性（识别关键的RRHT基序）及反应性（ELISA、Western Blot验证），还通过结构预测探讨了其作为线性B细胞新表位（B-cell neoepitope）的潜力。尽管在细胞（ICC）和组织（IHC）中的检测信号较弱，但这些抗体为解析COL11A1在癌症（如胰腺导管腺癌，PDAC）肿瘤微环境中的作用、及未来开发靶向治疗策略提供了重要的新型工具。
引言
胶原蛋白XIα1是由COL11A1基因编码的一种次要纤维状胶原蛋白。在多种人类癌症中，其表达显著上调，且与肿瘤的侵袭性和不良预后密切相关。它主要由癌症相关成纤维细胞（CAFs）中的一个亚群——表达LRRC15、ITGA11和分泌MMP-11的肌成纤维细胞——产生，并在侵袭性癌的促结缔组织增生反应中扮演重要角色。根据与其他胶原蛋白的类比，人类前胶原蛋白XIα1在分泌后会被细胞外蛋白酶加工，切除N端和C端前肽。成熟胶原蛋白XIα1的C端21个氨基酸残基（1543）IQPLPILSSKKTRRHTEGMQA（1563）被认为是其假定的非螺旋C端端肽。针对此C端端肽的特异性单克隆抗体，将有助于阐明人类前胶原蛋白XIα1的实际加工过程，并更好地表征表达COL11A1的肿瘤及其细胞外基质微环境，甚至可能发展为未来的治疗工具。然而，在此之前，针对此区域的抗体尚未被成功制备。
材料与方法
本研究使用了多种重组蛋白作为抗原，包括由GenScript提供的、在CHO细胞中表达的人类胶原蛋白XIα1重组形式（包含C端端肽序列）、C端前肽，以及由Proteintech提供的、去除GST标签后N端19个残基为C端端肽序列的COL11A1融合蛋白。研究团队合成了靶向C端端肽不同氨基酸序列（RRHTEGMQA和EGMQADADD）的肽段-载体蛋白偶联物作为免疫原。
通过用KLH-Cys-GG-RRHTEGMQA免疫BALB/c小鼠，并进行杂交瘤技术，成功筛选出两株分泌单克隆抗体（mAbs）的杂交瘤细胞，分别命名为抗-colXIα1克隆3和抗-colXIα1克隆9。两种抗体均为IgG1, kappa亚型。研究采用酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白质印迹法（Western Blot）、可溶性肽竞争抑制实验、免疫细胞化学（ICC）和免疫组织化学（IHC）等多种方法系统评估了抗体的反应性和特异性。此外，还通过全转录组测序（RNA-Seq）分析了抗体的可变区（V）基因序列，并利用PEP-FOLD4服务器对相关肽段进行了结构预测。
结果
1. 单克隆抗体反应性
两株杂交瘤的初始上清在ELISA中均显示出对重组人类胶原蛋白XIα1的强反应性，但对重组C端前肽或高表达COL11A1的A204细胞、低表达的A549细胞的裂解物无反应。可溶性肽竞争实验表明，游离的N-乙酰化RRHTEGMQA肽能剂量依赖性地抑制两种抗体对胶原蛋白XIα1的识别，而EGMQADADD肽或无关的对照肽则无此抑制作用，证明抗体特异性识别RRHTEGMQA序列，且RRHT基序对表位识别至关重要。
鉴于两株抗体遗传特征近乎相同，后续深入分析主要集中在纯化后的抗-colXIα1克隆9抗体上。ELISA结果证实，该抗体能与胶原蛋白XIα1及（程度较低的）COL11A1融合蛋白反应，但不与缺乏RRHTEGMQA序列的C端前肽反应。Western Blot分析进一步确认，抗-colXIα1克隆9抗体能特异性识别包含RRHTEGMQA序列的重组胶原蛋白XIα1和COL11A1融合蛋白，而非C端前肽。
2. 肽段结构预测
利用PEP-FOLD4对相关肽段进行结构预测显示，在COL11A1融合蛋白的N端50个氨基酸（包含端肽序列）和GenScript重组胶原蛋白的C端50个氨基酸模型中，RRHTEGMQA氨基酸序列均位于一个无序区域，其构象允许抗体接近。而游离的RRHTEGMQA肽则呈明显的α-螺旋结构。这些预测与ELISA和Western Blot结果相结合，表明抗-colXIα1克隆9抗体识别的表位行为类似于线性表位，其中RRHT氨基酸残基的识别至关重要。
3. 两种单克隆抗体的遗传特征分析
V(D)J基因测序分析证实，两种抗体均使用同一套胚系基因片段构建其重链和轻链可变区，其互补决定区（CDRs）的氨基酸序列几乎完全相同，这解释了它们高度相似的免疫反应性。每个抗体的六个CDR的组合在已知的免疫球蛋白中是独特的，证明了这两种抗体的新颖性。两株杂交瘤细胞已按规定保藏。
4. 免疫细胞化学与免疫组织化学分析
使用纯化的抗-colXIα1克隆9抗体进行免疫染色。在已知COL11A1阳性的A204和NCI-H661癌细胞系中，该抗体仅产生非常微弱的免疫染色信号，而在COL11A1几乎不表达的A549细胞中则无信号。在具有强烈促结缔组织增生反应的人类胰腺导管腺癌（PDAC）组织样本中，未观察到清晰的免疫染色模式。因此，在现有实验条件下，该抗体未能实现对培养细胞或组织切片中胶原蛋白XIα1的可靠检测。
讨论
目前，对人类前胶原蛋白XIα1表达的分子生物学机制了解甚少。基于与其他胶原蛋白的相似性，推测其C端端肽参与分子间交联，并在细胞外胶原纤维的组装中起到成核作用。由于被大量的I、II、III型主要纤维状胶原蛋白所包围，这个C端端肽在形成的纤维表面可能处于“埋藏”状态，从而阻碍了抗体的识别。然而，在细胞外蛋白酶切割和后续加工步骤时，它可能暴露出来。
本研究中成功获得的两株单克隆抗体特异性识别人类胶原蛋白XIα1 C端端肽中的RRHTEGMQA九肽序列。结合结构预测和实验结果，该表位应主要被视为一个线性B细胞新表位，因为它在前胶原中并不以此形式存在。该抗体在组织和细胞中检测信号微弱的结果，似乎也支持了C端端肽在肿瘤微环境细胞外基质中处于“埋藏”状态的假设。当然，也可能是其在体内的构象或未知的修饰导致了抗体无法识别。
已有研究表明，针对人类胶原蛋白Iα2 C端端肽的抗体能够降低BMP-1对C端前肽的切割速率，并在体外和类瘢痕器官模型中限制细胞外纤维的形成。因此，针对人类胶原蛋白XIα1成熟形式C端端肽的抗体，有可能通过干扰前胶原的加工步骤，从而抑制表达COL11A1基因的肿瘤进展，展现出治疗潜力。
本研究的一个主要局限是缺乏纯化的人类前胶原蛋白XIα1重组形式，也未对其酶切加工过程进行实验验证。因此，人类胶原蛋白XIα1假定C端端肽的真实性质、特征，以及本研究的抗体是否能识别体外和体内加工后的产物，仍有待精确确定。
结论与未来展望
本研究首次成功制备了针对人类胶原蛋白XIα1假定C端端肽的高特异性单克隆抗体。它们似乎识别一个独特的线性B细胞新表位（尽管“新表位”的概念仍需通过天然前胶原加工实验来证实）。这些抗体将有助于研究人员分析人类前胶原蛋白XIα1的细胞生物学，并更好地表征COL11A1阳性肿瘤。此外，如果它们能够干扰表达COL11A1的基质细胞和癌细胞，未来也可能具备体内治疗的应用潜力。
