《Antibodies》：Discovery of Anti-SARS-CoV-2 XBB.1.5 and JN.1 Variant-Specific Monoclonal Single-Domain Antibodies from a Synthetic Library
Isamu Tsuji,
Kumiko Okada,
Benjamin Kroppen,
Tetsufumi Katta,
Kaori Yamamura,
Takeshi Nishihama,
Ayako Miura,
Hansj?rg G?tzke,
Eric Crampon and
Andrea Bertolotti-Ciarlet
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本文为应对SARS-CoV-2快速变异带来的疫苗质量控制挑战，报道了一种不依赖动物免疫的快速单域抗体（sdAb）发现策略。研究者利用基于羊驼框架的合成文库，在8-9周内成功筛选出了特异性针对奥密克戎（Omicron）亚变体XBB.1.5和JN.1的sdAb。其中，抗JN.1 sdAb克隆1B9能够通过Western blot（WB）精确区分JN.1疫苗与先前武汉、BA.5及XBB.1.5疫苗株，其结合表位包含关键的L455S逃逸突变。该研究为快速开发新型变异株的特异性检测试剂提供了高效、可行的技术路径，对加速疫苗研发与质控流程具有重要意义。
1. 引言
2019年底出现的SARS-CoV-2病毒引发了全球大流行。病毒的快速变异是其逃避人体免疫系统的主要方式，也导致了病毒主导毒株的不断更迭：2020年的武汉株，2021年的阿尔法（Alpha）和德尔塔（Delta）株，2022年的奥密克戎（Omicron）变异株（BA.1, BA.2, BA.5），以及2023年初在美国占主导的XBB.1.5和2024年1月盛行的JN.1株。尽管病毒毒性逐渐减弱，住院患者的病死率（Case Fatality Rate, CFR）在两年半内下降了96%，但持续出现的新变种对公共卫生构成了长期挑战。疫苗的开发和应用是遏制病毒传播的关键，但针对新变种的疫苗必须经过严格的鉴定测试，以确认其针对的是正确的毒株，而非以往株。根据美国食品药品监督管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）的指导，这种疫苗鉴定测试是一种定性检测，需能验证新的SARS-CoV-2疫苗株。酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）和Western blot等免疫学测定方法，因操作方便，是蛋白基疫苗毒株验证的首选。因此，开发高灵敏度和特异性的单克隆抗体（Monoclonal Antibody, mAb）作为关键试剂至关重要，尽管这些抗体不一定需要具备中和活性。
传统通过小鼠或兔子免疫来发现mAb的方法通常需要数月，难以跟上SARS-CoV-2快速变异的步伐。另一种利用合成抗体文库的方法则无需动物免疫，可大幅缩短抗体发现周期。然而，常见的人源单链可变区片段（Single-Chain Variable Fragment, scFv）和抗原结合片段（Fragment Antigen-Binding, Fab）文库存在易聚集、溶解性低、在E. coli中表达困难等问题。大羊驼、羊驼和骆驼的免疫球蛋白具有独特的结构，其抗体缺乏轻链，可以很方便地构建单域抗体（Single-Domain Antibody, sdAb）文库。基于此，本研究旨在利用合成sdAb文库，快速开发针对SARS-CoV-2特定变体（XBB.1.5和JN.1）的sdAb，以应对新变体不断出现的挑战。
2. 材料与方法
2.1. 材料
研究使用了武汉株、XBB.1.5和JN.1变体刺突蛋白的受体结合域（Receptor-Binding Domain, RBD）以及血管紧张素转换酶2（Angiotensin-Converting Enzyme 2, ACE2）蛋白，这些蛋白由Trenzyme公司生产，部分进行了C端生物素化标记。BA.5 RBD蛋白购自The Native Antigen公司。高精度链霉亲和素（Streptavidin, SAX）生物传感器购自Sartorius公司。
2.2. 抗SARS-CoV-2 sdAb的发现
研究者开发了一个基于羊驼sdAb框架的合成文库，其三个互补决定区（Complementarity-Determining Regions, CDRs）具有自由度。从文库中筛选抗原特异性sdAb克隆的过程包括三轮淘选：先进行一轮核糖体展示，再进行两轮噬菌体展示。在每轮淘选中，使用浓度递减的生物素化XBB.1.5或JN.1 SARS-CoV-2 RBD蛋白作为诱饵。同时，在淘选过程中使用先前已制备疫苗株的RBD蛋白（针对XBB.1.5筛选使用武汉RBD，针对JN.1筛选使用武汉、BA.5和XBB.1.5 RBD）作为反向选择物，以去除通用的RBD结合物，从而获得株系特异性。淘选后，通过酶联免疫吸附试验筛选不与反向选择蛋白或链霉亲和素交叉反应的单个阳性克隆。根据此标准，从450个XBB.1.5单克隆中筛选出384个，从96个JN.1单克隆中筛选出3个。随后，根据CDR序列的特异性、亲和力及其氨基酸序列在阳性克隆中的独特性，最终筛选出5个独特的XBB.1.5特异性sdAb和2个独特的JN.1特异性sdAb。其中，基于CDR3区的同源性和更长的CDR3氨基酸序列，从5个抗XBB.1.5 sdAb中选择了两个用于构建sdAb-兔Fc片段（Fragment Crystallizable, Fc）融合蛋白。这些sdAb和sdAb-Fc融合蛋白分别在E. coli和哺乳动物细胞中表达，并使用亲和纯化树脂进行纯化。
2.3. CDR氨基酸序列分析
使用国际免疫遗传学信息系统（The International ImMunoGeneTics Information System, IMGT）的IMGT-V-Quest工具分析了抗XBB.1.5和抗JN.1 sdAb的CDR氨基酸序列。
2.4. 酶联免疫吸附试验
通过将RBD蛋白捕获在包被了中性亲和素（Neutravidin）的96孔板上进行ELISA。简要步骤包括：用中性亲和素包被、封闭、加入RBD蛋白、加入不同浓度的待测抗体、加入辣根过氧化物酶偶联的二抗、使用ABTS底物显色并在405nm处测量吸光度。
2.5. 平衡解离常数测量
使用Octet HTX系统进行抗体动力学分析。将生物素化RBD蛋白捕获在SAX生物传感器上，然后与不同浓度的抗体结合和解离，从而计算平衡解离常数（Equilibrium Dissociation Constant, KD）。
2.6. ACE2/RBD蛋白抑制试验
同样使用Octet HTX系统进行。先将生物素化RBD蛋白捕获在生物传感器上，再加入不同浓度的sdAb-Fc融合蛋白与RBD结合，最后加入ACE2蛋白。通过比较有无抗体存在时ACE2的结合响应，计算抗体的抑制活性。
3. 结果
研究者成功从合成文库中发现了五个XBB.1.5特异性sdAb克隆和两个JN.1特异性sdAb克隆。其中，抗JN.1 sdAb克隆1B9在疫苗鉴定测试中表现优异，通过Western blot能够特异性检测JN.1疫苗制品，而不会与之前生产的武汉、BA.5和XBB.1.5疫苗株发生交叉反应。通过氢-氘交换质谱确定了抗JN.1 sdAb克隆1B9的四个结合表位，其中包括了JN.1毒株逃避中和抗体的一个关键氨基酸突变L455S。
4. 结论
本研究在8-9周内，从未经动物免疫的合成单域抗体文库中，成功发现了针对SARS-CoV-2奥密克戎亚变体XBB.1.5和JN.1的特异性单域抗体。所获得的sdAb被成功应用于疫苗鉴定测试。这项工作展示了一种快速、高效的抗体发现平台，能够紧跟SARS-CoV-2等快速突变病毒的进化步伐，为未来新发变异株的特异性检测试剂和疫苗质量控制工具的快速开发提供了强有力的技术方案。
