靶向人表皮生长因子受体的骆驼源纳米抗体：筛选、表达与功能验证

《Antibodies》：Camelid-Derived Nanobodies Targeting Human Epidermal Growth Factor Receptor: Screening, Expression, and Functional Validation Yunfeng Liu, Qiting Huang, Dongna Zhang, Yingjun Wang, Shuaiying Zhao, Jianchuan Wen, Yingying Kong and Jianfeng Xu

本综述聚焦于利用骆驼免疫与噬菌体展示技术，成功筛选出靶向EGFR（表皮生长因子受体）的两种高亲和力纳米抗体Nb2H4与Nb2B6。研究通过生物物理、细胞学与功能验证，系统证明了其特异性、高亲和力、不重叠的表位结合特性及初步抑制肿瘤细胞增殖的活性，为肿瘤靶向治疗和分子工具开发提供了新利器。

　　

1. 引言

表皮生长因子受体（EGFR）是ErbB家族的一种跨膜受体酪氨酸激酶，是调节细胞增殖与存活的关键因子。当配体（如表皮生长因子，EGF）与EGFR的胞外域结合后，会诱导受体二聚化并激活其胞内激酶活性，从而启动下游信号通路，如RAS-MAPK通路和PI3K-Akt通路，这些通路在肿瘤的发生发展中起着至关重要的作用。EGFR在多种实体瘤中常出现过表达或异常激活，与肿瘤的侵袭性行为和不良临床预后密切相关。尤其是在缺乏ER、PR和HER2等经典受体的三阴性乳腺癌中，EGFR备受关注，被视为一个极具潜力的治疗靶点。

然而，现有抗EGFR治疗策略，如单克隆抗体（如西妥昔单抗）和小分子抑制剂（如吉非替尼）存在分子量大、组织穿透性差、免疫原性高等局限性。纳米抗体源自骆驼重链抗体，是一种单域抗体片段（VHH）。与传统抗体相比，纳米抗体具有分子量小（约15 kDa）、亲和力高、热稳定性好、溶解性高、免疫原性低等优点。其单域结构便于在大肠杆菌（Escherichia coli）或酵母系统中高效表达，非常适合用于大规模的筛选和分子工程改造。此外，纳米抗体具有更好的实体瘤穿透能力，是构建多价抗体、双特异性融合蛋白、抗体药物偶联物（ADC）和靶向递送平台的理想模块。

尽管已有一些针对EGFR的纳米抗体被报道，但大多数研究集中于单个候选分子和应用验证，对亲和力、表位关系及其作为模块化抗体资源的适用性的系统性比较分析有限。特别是，能够识别EGFR不同、非竞争性表位的成对纳米抗体鲜有被系统性生成和实验验证。本研究旨在填补这一空白，通过生成和表征一对定义明确的EGFR特异性纳米抗体，为EGFR相关研究和工程应用提供特征清晰的抗体资源。

2. 材料与方法

2.1. 实验设计与靶点准备

研究者首先构建了编码人EGFR全长（第1-1210位氨基酸）及其胞外域（第25-645位氨基酸）的表达载体。其中，胞外域被克隆到CMV-FLAG表达载体中，并为了便于后续筛选，在C端融合了Avi标签，以便进行体外生物素化，构建了hEGFR(25–645)-Avi-CMV-FLAG质粒。这些重组蛋白在HEK-293F细胞中通过瞬时转染表达，并通过抗FLAG亲和层析结合尺寸排阻层析进行纯化，获得了高纯度的蛋白。Avi标签化的蛋白通过BirA酶进行体外生物素化，并通过Western blot验证了生物素化效率。

2.2. 骆驼免疫与纳米抗体库构建及筛选

研究选用健康的成年双峰驼进行免疫，免疫原为瞬时表达人EGFR全长的HEK-293F细胞裂解物。经过初次免疫和多次加强免疫后，采集外周血分离单核细胞。提取总RNA并逆转录为cDNA后，通过巢式PCR扩增VHH基因片段，并将其克隆到pMECS噬菌体展示载体中，电转入Escherichia coliTG1感受态细胞，构建了库容超过1×10⁸CFU的噬菌体展示纳米抗体库。接着，通过两轮针对生物素化hEGFR(25–645)-Avi抗原的“生物淘选”，富集能够特异性结合EGFR的噬菌体克隆。淘选后，随机挑取克隆，通过间接ELISA筛选阳性克隆，并通过Sanger测序进行分析，最终获得了多个具有不同CDR3序列的候选纳米抗体。

2.3. 纳米抗体表达、纯化与表征

从阳性克隆中，研究者重点选择了两个纳米抗体，命名为Nb2H4和Nb2B6。将它们在大肠杆菌WK6菌株中表达，并通过镍亲和层析及尺寸排阻层析进行纯化，得到了高纯度的单体蛋白。通过多种生物物理和生化方法对这两个纳米抗体的性质进行了系统表征。

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  结合亲和力与动力学：使用生物层干涉技术（BLI，Octet系统）测定了纳米抗体与EGFR的结合动力学。Nb2B6的结合速率常数（k_on）为1.09 × 10⁶M^-1S^-1，解离速率常数（k_off）为2.08 × 10^-3S^-1，计算得出的表观平衡解离常数（K_D）约为1.93 nM。Nb2H4的结合速率常数（k_on）为8.1 × 10⁵M^-1S^-1，其解离速率极慢，超出了仪器的可靠检测下限（k_off< 1 × 10^-7S^-1），表明其具有极高的表观亲和力，可能达到皮摩尔级别。
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  表位关系分析：通过尺寸排阻色谱-高效液相色谱（SEC-HPLC）分析了纳米抗体与EGFR的结合模式。将EGFR分别与Nb2H4、Nb2B6单独孵育，或与两者共同孵育后进行分析。结果显示，在两种纳米抗体共存时，洗脱峰发生了进一步偏移，表明形成了三元复合物，这证明Nb2H4和Nb2B6结合在EGFR上不同且非竞争性的表位。

2.4. 细胞水平验证

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  流式细胞术分析：为了验证纳米抗体在天然细胞环境下识别EGFR的能力，研究选择了高表达EGFR的5637膀胱癌细胞系作为阳性模型，并以内源性EGFR表达极低的HEK-293T细胞作为阴性对照。流式细胞术结果显示，在5637细胞中，与仅使用二抗的对照组相比，Nb2H4和Nb2B6处理均能显著提高荧光阳性细胞比例，分别达到17.56%和24.04%。而在293T细胞中，两者的信号与对照组相近，阳性率均低于2%。这有力地证明了Nb2H4和Nb2B6能够特异性识别肿瘤细胞表面天然构象的EGFR。
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  功能活性评估：通过CCK-8细胞增殖实验评估了Nb2H4对EGFR信号通路的功能影响。在瞬时过表达人EGFR全长的HEK-293T细胞中，EGF（50 ng/mL）刺激可显著促进细胞增殖。当与不同浓度（10-150 nM）的Nb2H4共孵育时，Nb2H4能以浓度依赖的方式抑制EGF诱导的细胞增殖，在60 nM及以上浓度时显示出统计学上的显著抑制效果。而在没有EGF刺激的情况下，单独使用Nb2H4对细胞活力没有显著影响，表明其不具有细胞毒性或激动剂活性。

3. 结果与讨论

本研究成功实现了预期目标。通过免疫骆驼和噬菌体展示技术，成功筛选出两个靶向人EGFR的纳米抗体Nb2H4和Nb2B6。生物物理表征证实，两者均以高亲和力结合EGFR，且识别不同的、非竞争性的表位，这为构建双特异性或多价抗体提供了理想配对。细胞实验进一步验证了它们在天然细胞膜上识别EGFR的特异性。功能实验初步表明，Nb2H4能够有效抑制EGF诱导的EGFR过表达细胞的增殖，展现了其功能性应用的潜力。

4. 结论

综上所述，本研究成功构建了靶向人EGFR的噬菌体展示纳米抗体库，并筛选、表征了Nb2H4和Nb2B6这一对高亲和力、结合表位不重叠的纳米抗体。它们在细胞水平展示了良好的靶向特异性和初步的生物学功能。这些特征明确的纳米抗体为后续的EGFR相关基础研究（如表位作图、结构研究）和应用开发（如诊断探针、靶向药物递送系统、双特异性抗体工程等）提供了有价值的分子工具。未来的研究可以在更复杂的生理相关模型（如动物模型）中进一步探索其治疗潜力和应用前景。