《Antibodies》：Microsecond Dynamics of Fc–CD16a Recognition: Impact of Mutations, Core Fucosylation, and Fc Asymmetry
Sébastien Estaran,
Bernard Hehlen and
Alain Chavanieu
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这篇综述系统评估了基于纳体（VHH）的免疫分析法在检测细菌病原体与毒素方面的表现。综述纳入了截至2025年的32项研究，总结指出VHH凭借其小体积、高稳定性和工程灵活性，在多种检测平台（如ELISA、LFIA、电化学生物传感器）中展现出高灵敏度、高特异性与良好的基质耐受性，为开发快速、经济的生物传感器提供了关键元件。然而，现有研究大多使用人工加标样本，且缺乏与金标准方法的直接比较，未来需在天然污染样本验证、标准化报告和多重检测方面深入研究，以推动其向临床和食品安全现场检测的转化应用。
纳体免疫分析法检测细菌及细菌毒素：进展、局限与展望
摘要
快速、精确地检测细菌病原体及其毒素是全球公共卫生与食品安全领域的一项持续挑战。传统的检测方法，如平板培养、聚合酶链反应（PCR）和基于传统抗体的免疫测定，常受限于耗时长、操作复杂或成本高昂。纳米抗体（Nanobodies?），即来源于骆驼科动物（如羊驼、骆驼）的单域重链抗体（Variable domain of Heavy chain of Heavy-chain-only antibodies, VHH），以其小分子量、高稳定性、优异的溶解性和易于基因工程改造等独特优势，为新型免疫分析平台的发展提供了强大工具。本综述系统性地回顾了截至2025年的32项研究，评估了纳体免疫分析法在检测食源性细菌（如沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌）和毒素（如葡萄球菌肠毒素、肉毒杆菌毒素）方面的分析性能、功能表现与实际可行性。结果表明，纳体在酶联免疫吸附试验（ELISA）、侧向流动免疫层析（LFIA）、电化学与光热等多种传感平台中均表现出高灵敏度、高特异性及良好的基质耐受性。然而，现有研究也存在局限性，如大多依赖人工加标样本、与金标准方法的直接比较不足、以及试剂层面的质量控制报道有限。未来的研究需要致力于标准化验证、在真实样本中测试、开发多重检测技术，并关注成本效益与规模化生产，以推动纳体免疫分析技术从实验室走向实际应用。
1. 引言：为何需要纳体？
全球范围内，不安全的食品每年导致约6亿例疾病和42万人死亡。同时，抗菌素耐药性（AMR）在2021年直接导致了约114万人死亡。主要的食源性病原体包括大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和蜡样芽孢杆菌。这些病原体及其产生的毒素，对公共卫生和食品安全构成严重威胁。传统的检测方法，如培养法和PCR，虽然可靠，但通常耗时较长，无法满足现场快速检测的需求。
免疫分析法，特别是酶联免疫吸附试验（ELISA），因其特异性和简便性而被广泛应用。然而，传统单克隆抗体（mAbs）的生产涉及复杂的杂交瘤技术，周期长、成本高，且其较大的Fc片段可能在复杂基质中引起非特异性结合，影响检测特异性。单域抗体（VHHs），或称纳体，作为一种新型生物识别元件，恰好能弥补这些不足。纳体分子量小（约15 kDa），缺乏Fc片段，可有效减少非特异性结合；它们具有出色的热稳定性和化学稳定性；并且可通过原核表达系统（如大肠杆菌）进行低成本、大规模的重组生产，易于进行基因工程改造，例如与酶（如HRP）或纳米材料（如金纳米颗粒AuNP）融合，构建多功能检测探针。这些特性使纳体成为开发高灵敏度、高特异性、快速且经济的下一代免疫分析平台的理想选择。
2. 纳入研究与平台概况
本综述严格遵循PRISMA（系统综述和荟萃分析首选报告项目）指南，从多个数据库中筛选出2011年至2025年间发表的32项符合条件的研究。这些研究主要评估了纳体免疫分析法在食品（如乳制品、肉类）和临床样本中检测细菌和毒素的性能。
在所纳入的研究中，约59%聚焦于细菌检测，40%专注于毒素检测。检测的目标包括多种沙门氏菌血清型、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌，以及葡萄球菌肠毒素（SEA, SEB, SEC）、肉毒杆菌神经毒素（BoNT/A, BoNT/B）等。在分析平台方面，基于ELISA的检测方法占据主导地位，而侧向流动免疫层析（LFIA）、电化学生物传感器、纳米酶或光热/荧光等新兴检测方法的探索则相对不足。多重检测策略的研究也较为罕见。
3. 纳体免疫分析平台的技术特点与优势
纳体最核心的优势在于其可重组性，使其能够通过基因工程被灵活地整合到多种检测架构中，实现多功能化设计。
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高特异性与低背景：由于缺乏Fc区，纳体能够有效避免与样本基质中Fc结合蛋白（如细菌表面的Protein A）的非特异性相互作用，从而显著提高检测的特异性。例如，Ji等人（2021年）开发的针对SEC的VHH-ELISA，对相关的SEA、SEB及金黄色葡萄球菌全菌均未表现出明显的交叉反应。
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易于功能化工程改造：纳体可被改造为多种功能形式。例如，Lv等人（2025年）将靶向BoNT/A和BoNT/B的VHH与辣根过氧化物酶（HRP）融合，创建了可直接用于ELISA检测的HRP-VHH融合蛋白，简化了步骤。Wang等人（2023年）则将噬菌体展示的VHH与金纳米颗粒（AuNP）结合，利用靶标结合前后AuNP聚集状态的颜色变化，实现了对副溶血性弧菌的快速可视化和定量检测。
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稳定性与成本效益：纳体通常能在苛刻条件下（如高温、有机溶剂）保持稳定，适合现场检测。此外，利用大肠杆菌表达系统可以低成本、高产率地生产纳体（产量可达2.7–10 mg/L），为规模化应用奠定了基础。
4. 分析性能与现场应用潜力
纳体免疫分析法的性能在多种平台中得到了验证，展现出在灵敏度、速度和实用性方面的优势。
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高灵敏度与快速检测：通过创新的检测策略，纳体免疫分析的灵敏度得到了极大提升。Zhang等人（2022年）开发的噬菌体介导的化学发光ELISA（P-CLISA）用于检测鼠伤寒沙门氏菌，与传统的双纳体ELISA相比，灵敏度提高了约100倍，检测限（LOD）达到3.63 × 103CFU/mL。Wang等人（2025年）报道的基于定向固定纳体的金纳米颗粒侧向流动免疫层析法（Au/SA@Bio-Nb-LFIA），可在15分钟内检测牛奶、果汁和猪肉中的鼠伤寒沙门氏菌，LOD为103–104CFU/mL，回收率达81.23–105.01%。Lv等人（2025年）开发的用于检测肉毒杆菌毒素的时间分辨荧光免疫层析法（TRFICA），检测时间仅需15分钟，临床样本检测灵敏度高达98%。
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多重检测能力：纳体也被用于开发多重检测平台。Ren等人（2022年）设计了一种基于自配对VHH的链霉亲和素桥接ELISA（SAB-ELISA），可同时检测五种主要的沙门氏菌血清型。另一项研究开发了双信号放大的LFIA（D-LFIA）平台，可快速定量检测肠炎沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和空肠弯曲杆菌三种病原体，检测时间在13分钟内，灵敏度比传统单探针LFIA提高了32至54.9倍。
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成本效益：纳体本身的生产成本较低。一些创新的平台设计进一步降低了检测成本。例如，Zhang等人（2024年）开发的“RANbody”（报告基因-纳体融合体）夹心ELISA，将识别与催化功能合二为一，无需使用二抗，从而降低了成本和时间。
5. 与传统抗体免疫分析法的比较
多数研究通过间接或概念性比较，强调了纳体免疫分析法的优势。例如，由于没有Fc片段，纳体在复杂基质中的非特异性结合更低。然而，综述也指出一个关键局限：大多数研究并未在完全相同的实验条件下，将纳体免疫分析法与基于传统IgG的检测方法进行“头对头”的直接比较。性能的提升往往归因于检测平台架构的创新（如噬菌体展示、信号放大策略、纳米材料辅助），而不仅仅是纳体本身固有亲和力的优势。因此，要明确纳体相较于传统抗体的分析优势，未来需要更严谨的直接对比研究。
6. 研究的局限性与未来方向
尽管前景广阔，现有研究仍存在一些共性局限，制约了其向实际应用的转化：
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样本局限性：绝大多数研究（超过90%）使用的是人工加标的“模拟”样本，而非自然污染的“真实”样本。这可能导致在真实复杂样本基质中的性能被高估。
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验证与比较不足：许多研究缺乏与公认的金标准方法（如培养法、PCR）或商业检测试剂盒的平行比较。部分研究甚至没有设立任何参照方法，使得性能评估的可靠性存疑。
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试剂质量控制的缺失：研究普遍缺少对纳体试剂本身的深入表征，如单分散性、聚集状态、构象稳定性等。性能评估主要依赖于最终检测信号，这难以区分是纳体本身的优异特性，还是检测平台信号放大效应的结果。
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性能报告标准化不足：对灵敏度、特异性等关键性能指标的报告方式不统一，且仅有少数研究提供了明确的灵敏度百分比数值，这不利于不同研究间的横向比较和荟萃分析。
基于以上分析，未来的研究应聚焦于以下几个方向：首先，必须使用自然污染的食品和临床样本进行大规模验证，以评估真实世界中的检测能力。其次，需要建立标准化的性能报告指标和试剂质量控制流程。再次，应开展严格设计的、与最佳传统抗体方法的“头对头”比较研究。最后，应大力开发可用于同时筛查多种病原体/毒素的多重检测平台，并关注其成本效益、大规模生产的可行性以及与现场即时检测（POCT）设备的集成，以真正实现纳体免疫分析技术的转化应用。
7. 结论
本综述系统性地总结了纳体免疫分析法在检测细菌病原体与毒素方面的最新进展。VHHs凭借其独特的生化特性与高度的工程灵活性，已被成功集成到多种高灵敏、高特异的生物传感平台中。然而，现有研究大多停留在概念验证阶段，依赖加标样本，且缺乏标准化的性能比对和质量控制。未来的成功转化，有赖于在天然样本中进行严格的验证、开发标准化的评估流程、并致力于解决多重检测、成本控制及设备集成等实际应用中的关键问题。通过弥补这些研究空白，纳体免疫分析技术有望成为食品安全监测、临床诊断和环境检测领域强大而可靠的下一代分析工具。
