《Antibodies》：Generation of Schlafen 8-Specific Antibodies
Juan Carlos Silva-Espinoza,
Mauricio I. Rodriguez Rodriguez,
Claire Eunise Perucho,
Brian A. Terrazas,
Carlos Valenzuela,
Stephany Palos Vargas,
Andrea Carlin,
Diana L. Prospero,
Giulio Francia and
Manuel Llano
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本文成功开发并验证了一种能够特异性识别鼠源Schlafen 8 (SLFN8)蛋白的高特异性抗体。研究者通过生物信息学筛选出独特肽段，结合Poly(I:C)佐剂免疫策略，成功诱导了高滴度、高特异性的抗体应答。生成的抗体在多组织免疫印迹(Western blot)、免疫组化(IHC)、免疫沉淀(IP)及酶联免疫吸附试验(ELISA)等多种技术中均能有效区分SLFN8与其高度同源(86%氨基酸序列相同)的旁系同源蛋白SLFN9，填补了该领域缺乏可靠检测工具的空白，为深入研究SLFN8在免疫调节、病毒应答及肿瘤生物学中的功能提供了关键试剂。
引言
Schlafen (SLFN)蛋白家族是一类进化上保守、在脊椎动物中广泛存在但研究相对较少的蛋白。它们最初被发现与T细胞发育和胸腺细胞成熟相关，其名称“Schlafen”在德语中意为“睡眠”，源于SLFN1能够将细胞周期阻滞在G0/G1期。后续研究表明，SLFNs参与调控细胞增殖与分化、固有及适应性免疫通路、抗病毒限制、肿瘤细胞运动与侵袭抑制，以及通过破坏DNA损伤修复来增强化疗敏感性等多种细胞过程。在鼠类中，已鉴定出九个Slfn基因。SLFN8和SLFN9因其功能与人类SLFN11在DNA损伤修复和癌症化疗耐药中的作用相似而受到关注。然而，由于SLFN8与SLFN9的氨基酸序列相似性高达86%，目前缺乏能够特异性区分二者的商业化抗体，这严重阻碍了对其生理和病理功能的深入研究。本研究的核心目标正是开发并验证能够特异性识别鼠源SLFN8的抗体。
材料与方法
研究者首先对鼠源SLFN8和SLFN9蛋白进行氨基酸序列比对，鉴定出一个长度为13个氨基酸、具有61%序列差异性的独特肽段。通过AlphaFold结构建模和Kyte–Doolittle亲水性分析，预测该肽段位于蛋白质表面，具有较好的可及性和免疫原性。将该肽段与钥孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联，并联合使用Poly(I:C)作为佐剂，对BALB/c小鼠进行皮下免疫，免疫程序包括一次初始免疫(P)和三次加强免疫(1B, 2B, 3B)。通过化学发光酶联免疫吸附试验(CL-ELISA)监测免疫小鼠的抗体滴度。
为验证抗体特异性，研究者从C57BL/6和BALB/c小鼠中获取了脑、肺、心、肝、脾、肾等多种组织，利用定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测了Slfn8和Slfn9的转录水平。随后，通过免疫印迹(Western blot)和免疫组化(IHC)在蛋白水平上检测了内源性SLFN8的表达与定位。此外，研究还利用人胚胎肾细胞(HEK293T)和鼠成纤维细胞(NIH3T3)系，通过外源表达SLFN8的两个变异体(SLFN8v1和SLFN8v2)及SLFN9，评估了抗体在异源系统中的特异性。通过用α-干扰素(αIFN)处理或用西尼罗河病毒(WNV)感染NIH3T3细胞，探究了Slfn8和Slfn9基因表达的调控。最后，将融合了谷胱甘肽S-转移酶(GST)和FLAG标签的重组SLFN8v1蛋白在大肠杆菌(E. coli)中表达，并用免疫印迹进一步验证了抗体的特异性。利用免疫后小鼠的脾细胞，还进行了杂交瘤细胞的筛选，以期获得分泌SLFN8特异性单克隆抗体的细胞株。
结果
1. 独特SLFN8肽段的鉴定与免疫
序列比对发现SLFN8和SLFN9在C端存在两个差异区域。研究者选择了其中长度为13个氨基酸的肽段(肽段1)作为免疫原。结构建模证实该肽段位于一个预测为溶剂可及的β-折叠片中，亲水性分析也支持其适合作为B细胞表位。用此肽段-KLH复合物免疫小鼠后，ELISA结果显示，在首次加强免疫(1B)后，抗SLFN8肽段的IgG滴度显著升高，并随着后续免疫持续增加，表明该肽段具有很强的免疫原性，能够引发强烈的体液免疫应答。
2. SLFN8在不同小鼠组织中的表达验证
qRT-PCR分析显示，Slfn8和Slfn9的转录本在不同组织中存在差异表达。其中，脾脏的Slfn8mRNA水平最高，其次是肾、心、肺和脑，而在肝脏中表达最低。免疫印迹分析表明，生成的抗SLFN8肽段抗体能够在脑、肺和心脏组织中检测到一条分子量约为100-130 kDa的条带，与SLFN8的预期分子量(104 kDa)一致，但在脾脏中信号较弱，提示可能存在转录后调控。此外，抗体还检测到一些低分子量的条带，其性质尚不明确。免疫组化结果进一步证实，SLFN8蛋白在脑组织的脉络丛上皮细胞和实质散在细胞、肺的支气管和细支气管上皮细胞以及肺泡区域，以及心肌细胞中均有表达，且主要定位于细胞核内，这与SLFN8的已知亚细胞定位相符。
3. 炎症刺激对SLFN8表达的影响
在NIH3T3细胞中，WNV感染可显著上调Slfn8和Slfn9的mRNA水平，其中Slfn8的诱导程度更高。而αIFN处理则选择性地诱导了Slfn8的表达，对Slfn9无显著影响，表明Slfn8的调控与经典的干扰素信号通路更为密切。此外，对免疫后小鼠脾脏的免疫印迹分析显示，与未免疫的对照小鼠相比，免疫小鼠脾细胞中的SLFN8蛋白表达上调，进一步证实了免疫激活能够诱导SLFN8的表达。
4. 抗体在异源表达系统中的特异性验证
在HEK293T细胞中，SLFN8v1的外源表达水平极低，而SLFN8v2和SLFN9则能高效表达。qRT-PCR分析表明，Slfn8v1的mRNA丰度远低于Slfn8v2，提示存在转录后调控。尽管SLFN8v1表达量低，但通过免疫沉淀富集后，抗SLFN8肽段抗体和抗FLAG抗体均能成功沉淀SLFN8v1。当加大上样量时，抗SLFN8肽段抗体能够直接在细胞裂解物中检测到SLFN8v1，且不与大量表达的SLFN9发生交叉反应。同时，该抗体也不识别缺乏该肽段序列的SLFN8v2。这些结果充分证明了该抗体能够特异性识别SLFN8v1，而不与SLFN9或SLFN8v2发生交叉反应。
5. 利用重组蛋白验证抗体
研究者构建了在大肠杆菌中表达的重组GST-SLFN8v1-FLAG融合蛋白。虽然考马斯亮蓝染色无法直接观察到该融合蛋白条带，但通过免疫印迹，抗FLAG抗体和来自两只免疫小鼠的抗SLFN8肽段抗体均能特异性检测到该融合蛋白，进一步验证了抗体的特异性。检测中出现的低分子量条带，用抗FLAG抗体检测的条带可能源于融合蛋白的降解，而用抗SLFN8肽段抗体检测到的条带则可能是抗体与细菌蛋白的非特异性结合，但均不与GST本身发生交叉反应。
6. 抗SLFN8肽段杂交瘤的生成
通过杂交瘤技术，从两只免疫小鼠的脾细胞中成功筛选出54个能够特异性识别SLFN8肽段-BSA、而不与BSA单独反应的杂交瘤克隆，所有抗体均为IgG型，证明了该免疫策略能够有效诱导产生SLFN8肽段特异性抗体的浆母细胞，为后续单克隆抗体的制备奠定了基础。
讨论
本研究成功开发了一种能够高特异性识别鼠源SLFN8蛋白的抗体工具。通过针对一个独特的表面可及性肽段进行免疫，产生的多克隆抗体能够在内源性组织、外源性表达系统以及重组蛋白中有效检测SLFN8，且不与其高度同源的旁系同源蛋白SLFN9发生交叉反应。研究不仅揭示了Slfn8在不同组织中的差异表达模式及其在病毒和干扰素刺激下的特异性调控，还证实了免疫激活可上调脾细胞中SLFN8的蛋白水平。这些抗体填补了该领域长期缺乏特异性检测工具的空白，为未来深入研究SLFN8在自身免疫性疾病、抗病毒免疫、肿瘤生物学及更广泛的蛋白稳态调控中的具体分子机制提供了至关重要的实验工具。
